近年來，免疫檢查點阻斷療法（ICB）在對抗癌癥方面取得了很大進展。CTLA-4單抗是首個獲批上市的免疫檢查點抑制劑。作為一種抑制性檢查點，CTLA-4在活化T細胞和腫瘤浸潤調節性T（Treg）細胞上高表達。CTLA-4單抗不僅能夠增強效應T細胞的功能，還能清除腫瘤內Treg細胞。然而，部分患者無法響應CTLA-4單抗治療，而且治療還會產生嚴重的免疫治療相關不良反應。

腫瘤細胞為了維持生存會進行大量的有氧糖酵解，導致乳酸在腫瘤微環境中過度積累。目前已知Treg細胞利用乳酸來維持其免疫抑制功能。考慮到CTLA-4在Treg細胞中的重要性，乳酸是否調節Treg細胞中CTLA-4的表達，進而影響對CTLA-4阻斷療法的應答，這個問題值得深入探究。

近日，上海交通大學基礎醫學院鄒強研究員領導的研究團隊發現，乳酸通過RNA剪接機制促進腫瘤浸潤Treg細胞中CTLA-4的表達，有助于提高CTLA-4阻斷療法的效果。這項研究成果發表在《Immunity》雜志上，確定了Treg細胞中乳酸與RNA剪接之間的機制關聯，對自身免疫和抗腫瘤免疫具有治療方面的意義。
 

圖片來源：《Immunity》
（https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構建了多種條件性基因敲除小鼠模型（其中Slc16a1-floxed小鼠由賽業生物提供），以研究MCT1、USP39和CTLA-4蛋白的功能和關聯。他們利用Treg細胞的單細胞轉錄組數據分析了乳酸攝取對轉錄程序的影響。在分析蛋白質相互作用時，他們采用了RNA免疫沉淀（RIP）以及CUT&RUN方法。在體外實驗中，他們還從小鼠的脾臟和淋巴結中純化出初始CD4+ T細胞，并誘導其分化為Treg細胞。

技術路線
01 敲除小鼠Treg細胞中的乳酸轉運蛋白，以分析乳酸攝取對CTLA-4阻斷療法的影響
02 敲除小鼠Treg細胞和腫瘤浸潤Treg細胞中的USP39，以分析USP39的功能作用
03 探索乳酸攝取對Treg細胞轉錄程序的影響，分析USP39缺失是否改變RNA剪接
04 確定乳酸影響RNA剪接和CTLA-4表達的分子機制

研究結果
1. Treg細胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果
乳酸是由Treg細胞中的單羧酸轉運蛋白1（MCT1）轉運的。為了探討Treg細胞對乳酸的利用是否會影響CTLA-4阻斷療法，研究人員將Slc16a1-floxed小鼠（由賽業生物提供，MCT1由Slc16a1基因編碼）與Foxp3-Cre-YFP小鼠雜交，構建了條件性基因敲除小鼠（Slc16a1fl/flFoxp3-Cre），其Treg細胞中的Slc16a1被特異性敲除。

他們發現，CTLA-4抗體治療能有效阻止瘤內Treg細胞的聚集，并激發強烈的抗腫瘤T細胞反應。不過，Slc16a1fl/flFoxp3-Cre荷瘤小鼠對CTLA-4抗體治療未產生應答，它們在接受或未接受抗體治療的情況下，腫瘤生長和抗腫瘤免疫并無明顯差異，表明Treg細胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果（圖1）。
 

圖1 Treg細胞攝取乳酸有助于提高CTLA-4阻斷的效果[1]

2. RNA剪接機制與腫瘤浸潤Treg細胞特征有關
為了探索乳酸攝取對Treg細胞內在的轉錄程序有何影響，研究人員分析了結直腸癌中Treg細胞的單細胞轉錄組數據。他們發現，Treg細胞來源的RNA剪接過程與SLC16A1 mRNA的表達相關，且腫瘤浸潤Treg細胞的RNA剪接相關通路特征打分高于外周Treg細胞。此外，SLC16A1的表達與泛素特異性蛋白酶39（USP39）的表達呈正相關，而USP39是RNA剪接機制的組分之一。這些結果表明，Treg細胞中的RNA剪接與腫瘤微環境中Treg細胞特征有關。

3. USP39通過CTLA-4維持Treg細胞的功能
接下來，研究人員構建了條件性基因敲除小鼠（Usp39fl/flFoxp3-Cre），其Treg細胞中的Usp39被特異性敲除。他們發現，這些小鼠出現致命的自身免疫表型，其嚴重程度與Foxp3缺陷型小鼠和CTLA-4缺陷型小鼠類似，表明Treg細胞介導的免疫抑制存在嚴重缺陷。此外，USP39缺陷型Treg細胞無法表達Treg細胞的特征基因，包括Foxp3、Ctla4、Pdcd1和Il10。這些結果表明，USP39缺失會破壞Treg細胞身份，導致致命的自身免疫。

他們之后特異性敲除了腫瘤浸潤Treg細胞中的USP39，發現USP39的破壞明顯抑制了腫瘤進展并提高了小鼠的存活率。在USP39缺陷型Foxp3+ Treg細胞中，CTLA-4的表達較低。他們還進一步敲除了小鼠Treg細胞中的CTLA-4和USP39，發現能夠有效抑制腫瘤生長并促進抗腫瘤T細胞反應。不過在Ctla4fl/flFoxp3CreERT2荷瘤小鼠中，USP39缺失卻不會改變腫瘤生長或抗腫瘤T細胞反應，表明USP39通過CTLA-4維持Treg細胞的免疫抑制功能。

4. USP39促進Ctla4 RNA的高效剪接
那么，USP39缺失是否會改變Treg細胞的RNA剪接模式？轉錄組分析的結果表明，USP39缺失會導致1235個剪接事件發生改變，且USP39缺失導致50個和30個剪接位點的效率降低（圖2），表明USP39對Treg細胞中的RNA剪接至關重要。USP39的缺失也導致Ctla4表達下降。RNA免疫沉淀分析表明，USP39與Ctla4 pre-mRNA結合（圖2）。此外，USP39缺失會降低腫瘤浸潤Treg細胞中Ctla4成熟mRNA與pre-mRNA的比例。這些數據表明，USP39是Ctla4 RNA高效剪接所必需的。

圖2 USP39調節Treg細胞的RNA剪接程序[1]

之后，研究人員利用體外系統探索了USP39對Treg細胞功能基因的RNA剪接有何作用。與對照相比，USP39缺失會降低Ctla4成熟mRNA與pre-mRNA的比例，但不會改變其他Treg細胞功能基因的RNA剪接效果，這表明USP39的缺失會選擇性影響Treg細胞中Ctla4 RNA的剪接。雌性Usp39fl/flFoxp3-Cre/+小鼠的分析也證實了這一點，由于X染色體的隨機失活，大約一半的Treg細胞缺乏USP39。這些結果表明，USP39介導的RNA剪接是Treg細胞中CTLA-4表達所必需的。

5. 乳酸調節USP39介導的CTLA-4表達
最后，研究人員探究了Treg細胞中乳酸與USP39之間的潛在聯系。他們在Usp39的啟動子區域發現了Foxp3的結合位點。在乳酸處理后，Foxp3+ Treg細胞中USP39和CTLA-4表達水平增加，表明乳酸誘導Foxp3表達，然后促進Treg細胞中USP39依賴性的CTLA-4表達。在阻斷乳酸攝取后，Usp39表達和Ctla4 RNA剪接效率降低，但USP39缺陷型Treg細胞中Ctla4 RNA剪接的效率沒有改變。這些結果表明，在腫瘤浸潤Treg細胞中，乳酸調節了USP39介導的CTLA-4表達。

研究結論

圖3 Treg細胞中乳酸與RNA剪接之間的機制[1]

這項研究表明，乳酸通過調節RNA剪接來增加CTLA-4的表達并增強Treg細胞的免疫抑制功能，這有助于提高CTLA-4阻斷療法的效果。這些發現確定了一種環境機制，它能夠維持Treg細胞內RNA剪接機制的活性，進而支持Treg細胞的功能狀態和CTLA-4阻斷的應答。研究還表明，抑制USP39可能會降低Treg細胞的抗腫瘤免疫屏障，對腫瘤治療產生影響。

參考文獻：
[1]Ding et al., Lactate modulates RNA splicing to promote CTLA-4 expression in tumor-infiltrating regulatory T cells, Immunity (2024), https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.01.019
 

賽業小鼠模型構建

賽業生物構建了Slc16a1基因敲除小鼠與條件性基因敲除小鼠，更有活體小鼠已加入『智鼠商城』，快至2周交付！確保您在短時間內獲得更具性價比的實驗用鼠，為您的研究加點速~

Slc16a1 KO小鼠

小鼠福利，限定發放中~
品系名稱：
C57BL/6JCya-Slc16a1em1/Cya
品系編號：
KOCMP-20501-Slc16a1-B6J-VB
產品編號：
S-KO-16927
應用方向：
免疫,腫瘤,代謝等
打靶方案：

Slc16a1 flox小鼠

小鼠福利，限定發放中~
品系名稱：
C57BL/6JCya-Slc16a1em1flox/Cya
品系編號：
CKOCMP-20501-Slc16a1-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-05084
應用方向：
免疫,腫瘤,代謝等
打靶方案：