7月18日，賽業生物細胞基因編輯項目管理常天一主講「基因編輯細胞技術及其研究應用」線上課程，以下為本次直播常見問題匯總與解答。

FAQ:
1.細胞編輯移碼敲除和片段敲除該如何選擇？
2.如何提高點突變項目的成功率？
3.基因敲入細胞系構建原理？
4.iPSC重編程都會做哪些檢測？
5.敲除細胞系出現WB檢測蛋白殘留該如何解決？
6.基因敲除細胞系構建的實驗難點和注意事項？
 

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Q：細胞編輯移碼敲除和片段敲除該如何選擇？
A ：移碼敲除是指使用一條sgRNA在蛋白編碼基因的外顯子內產生雙鏈斷裂，若NHEJ修復導致了缺口處產生了非3倍數的刪除或者插入，則會造成蛋白翻譯時的讀碼框移碼（Framshift），從而產生一個截短的、功能失活的蛋白質。

片段敲除是指在目的敲除位置兩側各設計一條gRNA，兩條gRNA同時作用形成兩個DSB，NHEJ修復造成目的DNA片段的缺失，從而導致該片段中包含的基因失去功能。

兩種方案都是可行的敲除方案，我們會根據目的基因信息，是否有文獻報道等情況，綜合考量使用哪種方案。

Q：如何提高點突變項目的成功率？
A：點突變的項目的成功率和cell pool階段的同源重組效率密切相關。賽業生物優化的α-donor體系將人源化的Cas蛋白、gRNA和donor三組分轉染至目的細胞，HDR效率高達87%，實現單克隆純合子交付，快至6周。

Q：基因敲入細胞系構建原理？
A：sgRNA和Cas蛋白使目的位置發生雙鏈斷裂，同時引入了一個donor，donor中包含要插入的DNA序列、和目標基因組位置同源的DNA序列（同源臂），利用同源重組修復（HDR）機制來修復雙鏈斷裂，將外源DNA序列插入到目標位置。

Q：iPSC重編程都會做哪些檢測？
A：iPSC重編程檢測內容包括無菌支原體檢測、質粒殘留分析、STR鑒定、核型分析、免疫熒光、流式檢測、體外三胚層檢測，畸胎瘤實驗。

Q：敲除細胞系出現WB檢測蛋白殘留該如何解決？

A：出現WB檢測蛋白殘留可能的原因：
Western Blot抗體的選擇不合適；
基因的可變剪切引起的蛋白殘留；
由于目的基因的多轉錄本引起的蛋白殘留；
目的蛋白本底表達低；
遺傳補償效應：無義突變和同源序列。

可參考Western blot trouble shooting思路圖進行原因排查。

1.細胞和基因信息分析
確保細胞和基因的準確性；
核對敲除策略和gRNA設計位置，確保gRNA設計在保守區域且盡可能覆蓋所有轉錄本；
分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能會存在遺傳補償效應；
分析目的基因在宿主細胞內的本底表達水平，相應調整Western blot參數。

2.DNA水平分析
檢查鑒定策略是否合適，PCR電泳條帶與預期是否一致；
核查測序原始數據，測序質量是否合格，分析測序結果檢查是否還有未敲除干凈的序列，與野生型序列進行比對確保敲除成功。

3.mRNA水平分析
兩種方法可以在mRNA水平進行驗證：
方法1：使用賽業生物RDDC罕見病數據中心對突變進行可變剪切預測，如產生移碼和提前終止，則認為mRNA水平敲除合格。
方法2：提取細胞mRNA進行cDNA PCR和測序，并與野生型進行比對，確定mRNA水平是否敲除成功。

4.蛋白水平分析
根據DNA測序結果，使用相應軟件將KO后的DNA翻譯成氨基酸序列，并與野生型氨基酸序列進行比對，確定氨基酸水平是否發生敲除。

5.抗體分析
KO驗證和文獻驗證更優，比對抗體免疫原位點與敲除區域位點，免疫原位點C端優于N端，核對抗體是單克隆或者多克隆，單克隆優于多克隆；抗體的品牌，進口優于國產。

Q: 基因敲除細胞系構建的實驗難點和注意事項？

A：1.分子設計方面的難點：
敲除策略選擇不當；
基因拷貝數多，gRNA切割不徹底；
gRNA設計位置不當，如未能覆蓋重要轉錄本；
gRNA設計不當，如效率低，脫靶率高等。

解決方法：在分子設計方面結合賽業生物Smart CRISPR基因編輯系統和經驗豐富的生信分子團隊進行相應的基因分析和設計，確保敲除成功。

2.細胞方面的難點：
遞送方式、培養、轉染和單克隆制備困難。

解決方法：遞送方式建議選擇RNP，效率高且低脫靶，摸索細胞培養條件，優化轉染方法和單克隆，確保敲除實驗前獲取最優條件。