心血管疾病（CVD）在全球范圍內造成的死亡遠超癌癥。動脈狀硬化（AS）作為一種慢性炎癥性疾病，是多種CVD的共性病理基礎。靶向IL-1β的單克隆抗體藥物Canakinumab的臨床試驗（CANTOS）首次證實了AS抗炎治療以及干預NLRP3炎癥小體激活作為治療手段的可行性。血管內皮細胞（EC）激活是AS發生的使動因素，通過介導白細胞的黏附和泡沫細胞的形成等參與了AS進程，但其機制尚未闡明。糖酵解（Glycolysis）過程在內皮多種病理狀態下功能實現中發揮了關鍵作用，但其對NLRP3炎癥小體及AS發生發展的作用和調控機制尚不清楚。

2024年4月17日，廣州醫科大學基礎醫學院心血管平臺徐益鳴教授團隊在Cardiovascular Research（醫學1區，IF=10.9）上發表了題為“Endothelial nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome regulation in atherosclerosis”的研究論文，揭示了內皮細胞中PFKFB3介導的糖酵解對NLRP3炎癥小體激活的全新調控通路及其在AS進程中的關鍵作用，為抗AS治療提供了全新的代謝干預靶點。該論文的通訊作者為徐益鳴教授，第一作者為廣州醫科大學博士生郭帥和復旦大學中山醫院博士生王立濤。
 

圖片來源：《Cardiovascular Research》
（https://doi.org/10.1093/cvr/cvae071）

研究材料
在此項目中，研究人員構建了Apoe^-/-背景的內皮特異性PFKFB3敲除小鼠模型（Pfkfb3^VEC-KO）探究內皮PFKFB3對NLRP3炎癥小體激活及AS進程的調控作用。隨后使用AAV病毒（由賽業生物提供）實現了在內皮中對CtBP1的點突變，并進行了詳細的下游機制驗證。

研究方法
在此項目中研究人員采用了多項實驗技術并結合轉錄組測序，包括en face免疫熒光、主動脈油紅O染色、Western blotting及Real-time PCR等。在探究CtBP1與FOXP1的結合對NLRP3炎癥小體組分轉錄調控作用時，研究人員使用了CHIP及熒光素酶報告基因實驗。此外，研究人員還測量了胞內NADH的水平。

技術路線
01 AS中NLRP3炎癥小體與PFKFB3的表達相關性
02 體內外抑制PFKFB3對NLRP3炎癥小體及AS進程的影響
03 PFKFB3調控NLRP3炎癥小體的分子機制
04 CtBP1寡聚化對NLRP3炎癥小體和AS的調控作用及其機制

研究結果
1. AS斑塊中NLRP3及PFKFB3在內皮細胞中高表達
首先，研究人員發現在人頸動脈AS斑塊中發現NLRP3和PFKFB3在內皮細胞中高表達，并且二者存在線性關系（R²=0.4272，P=0.0212）。en face免疫熒光實驗證實，與野生型小鼠相比，Apoe^-/-小鼠的主動脈內皮中的PFKFB3和NLRP3水平明顯升高。提取主動脈內膜RNA行Real-time PCR實驗，結果表明Apoe^-/-小鼠的主動脈內皮中的PFKFB3、NLRP3、CASP1以及IL-1β基因的轉錄水平明顯升高。以上結果提示PFKFB3與NLRP3的表達量與AS的發生發展相關，且二者之間存在顯著相關性。

圖1 NLRP3及PFKFB3在AS病理狀態下的內皮細胞中高表達^[1]

2. 內皮PFKFB3介導了NLRP3炎癥小體和AS斑塊的形成
隨后，研究人員發現使用siRNA敲低PFKFB3或使用PFKFB3的特異性抑制AZ67可以顯著緩解TNFα刺激人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）及人主動脈內皮細胞（HAEC）所引起的NLRP3炎癥小體的形成和激活。隨后，干預PFKFB3所介導的糖酵解也可以抑制血流狀態下內皮與白細胞之間的相互作用。為了在體研究內皮PFKFB3對NLRP3炎癥小體激活和AS進程的影響，研究人員構建了內皮特異性PFKFB3敲除鼠（Pfkfb3^VEC-KO）。實驗結果表明，與對照鼠相比，Pfkfb3^VEC-KO小鼠的主動脈中NLRP3的表達明顯下調。給予小鼠高脂飲食喂養后，Pfkfb3^VEC-KO小鼠顯著緩解了AS斑塊的形成。以上結果提示，體內外干預內皮中的PFKFB3可以緩解NLRP3炎癥小體的形成和激活，并緩解AS斑塊的形成。此外，研究人員使用熒光素酶報告基因實驗發現，干預PFKFB3調控了NLRP3炎癥小體組分基因的轉錄活性。
 

圖2 內皮PFKFB3介導了NLRP3炎癥小體和AS斑塊的形成^[1]

3. 糖酵解依賴性的NADH水平介導了NLRP3炎癥小體形成
先前的研究表明，糖酵解速率升高所產生的NADH可以起到轉錄調控的作用，從而架起代謝與表觀遺傳調控之間的橋梁。研究人員首先發現，TNFA刺激顯著上調內皮中的NADH水平和NADH/NAD+的比例。隨后，研究人員發現使用丙酮酸降低NADH水平可以緩解NLRP3炎癥小體形成；相反，使用乳酸鈉回補實驗上調NADH水平則可以逆轉敲低PFKFB3所產生的保護效應。以上結果提示PFKFB3介導糖酵解的對NLRP3的調控作用依賴于胞內NADH水平的改變。
 

圖3 糖酵解依賴性的NADH水平介導了NLRP3炎癥小體形成^[1]

4. NADH敏感型蛋白CtBP1的寡聚化介導了NLRP3激活和斑塊形成
先前的研究表明，CtBP1是NADH敏感型蛋白之一，通過響應胞內不斷變化的NADH水平發揮轉錄調控作用。首先，結果表明TNFA促進了CtBP1的寡聚化。隨后，研究人員使用CtBP1寡聚化抑制劑MTOB及突變CtBP1的寡聚化關鍵位點（G183A）可以緩解NLRP3炎癥小體的形成和激活。隨后研究人員構建了內皮細胞CtBP1(G183A)過表達AAV病毒（試驗所用AAV病毒由賽業生物提供）。給予Apoe^-/-小鼠尾靜脈注射CtBP1(G183A)過表達AAV病毒可以顯著抑制NLRP3炎癥小體的形成和AS進程。
 

圖4 CtBP1的寡聚化介導了NLRP3激活和斑塊形成^[1]

5. 單體形式的CtBP1與FOXP1結合抑制NLRP3組分基因的轉錄
CtBP1發揮轉錄調控作用需要與之協同的轉錄因子，研究人員通過生物信息學工具預測了CtBP1的結合蛋白及共同調節NLRP3、CASP1及IL-1β基因的轉錄因子。并通過IP、CHIP及熒光素酶報告基因實驗證實單體形式的CtBP1與轉錄因子FOXP1結合轉錄抑制了NLRP3炎癥小體組分基因的轉錄水平。
 

圖5 單體CtBP1與FOXP1結合抑制NLRP3組分基因的轉錄^[1]

研究結論
此項研究首次證實內皮PFKFB3介導的糖酵解調控了NLRP3炎癥小體的形成和激活和AS斑塊形成。機制探索表明糖酵解依賴性的NADH水平升高介導了CtBP1的寡聚化及其與FOXP1的解離，進而導致NLRP3炎癥小體組分基因的轉錄激活。此項研究也首次闡明干預CtBP1的寡聚化可以緩解AS進程，為AS防治提供了新的干預靶點。
 

圖6 機制圖^[1]

參考文獻：
[1]Shuai Guo, Litao Wang, Kaixiang Cao, Ziling Li, Mingchuan Song, Shuqi Huang, Zou Li, Cailing Wang, Peiling Chen, Yong Wang, Xiaoyan Dai, Xianglin Chen, Xiaodong Fu, Du Feng, Jun He, Yuqing Huo, Yiming Xu, Endothelial nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome regulation in atherosclerosis, Cardiovascular Research, 2024;, cvae071, https://doi.org/10.1093/cvr/cvae071