小鼠模型助力揭示人線粒體tRNAt6A修飾對線粒體基因表達調控的作用
tRNA在所有核酸分子中含有最多的轉錄后修飾，這些化學修飾對于穩定其結構和功能十分重要。其中N6-蘇氨酰基甲腺苷酸（t6A）修飾高度保守，發生在幾乎所有生物體和細胞器解碼ANN(N=A, T, G, C)密碼子的tRNA的37位腺嘌呤上。人線粒體tRNA上的t6A修飾由OSGEPL1和YRDC共同負責合成，但這一修飾在哺乳動物線粒體mRAN翻譯過程中發揮的作用尚不完全清楚。
2024年1月，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心周小龍/王恩多團隊在Nucleic Acids Research發表了題為“Multifaceted roles of t6A biogenesis in efficiency and fidelity of mitochondrial gene expression”的文章。分子細胞科學卓越創新中心周小龍研究員和王恩多研究員為本文的共同通訊作者。分子細胞科學卓越創新中心博士研究生張勇，周敬波為該論文的共同第一作者。
圖片來源：《Nucleic Acids Research》
（https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae013/7560177）
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構建了人OSGEPL1敲除細胞系以及Osgepl1全身敲除小鼠模型（由賽業生物提供）。此外，研究人員還運用了慢病毒在KO細胞中穩定表達了野生型及突變體OSGEPL1。該研究中作者采用了高效液相色譜-質譜檢測技術（LC-MS/MS），BN-PAGE，Northern blot，心臟超聲等實驗技術。
技術路線
01 構建OSGEPL1敲除細胞
02 發現t6A的缺失會導致其他修飾水平發生變化
03 t6A的缺失導致線粒體tRNA氨基酰化及翻譯準確性受到影響
04 穩定表達OSGEPL1可以回補上述缺陷
05 通過構建Osgepl1全身敲除的小鼠研究其對心臟功能產生的影響
研究結果
1 t6A37低修飾導致hmtRNAThr和hmtRNALys中m1A9和m2G10水平增加
本研究中，研究人員通過CRISPR-Cas9技術在HEK293T細胞上構建了敲除OSGEPL1的KO細胞系，首次發現t6A修飾的缺失會協同調控mt-tRNAThr和mt-tRNALys上第9位1-甲基腺嘌呤（m1A）和第10位2-甲基鳥嘌呤（m2G）的上調。這可能是由于TRMT10C啟動子活性增強使其mRNA水平升高并最終導致TRMT10C蛋白質水平的升高，進而使m1A9修飾水平上調。同時，t6A修飾的缺失也會導致這兩種tRNA的氨基酰化水平下調。
t6A37低修飾導致hmtRNAThr和hmtRNALys中m1A9和m2G10水平增加[1]
2 t6A37低修飾導致線粒體mRNA翻譯過程中出現多種氨基酸錯誤摻入
通過分離線粒體氧化磷酸化超復合物并進行質譜分析，研究人員發現t6A修飾的缺失會使臨近37位的36位反密碼子“A”錯誤識別其他堿基并導致多種線粒體遺傳密碼解碼錯誤。線粒體翻譯效率及精確性的下降導致線粒體氧化磷酸化復合物表達及活力的減弱并進一步導致線粒體結構及功能的異常和線粒體UPR的激活。
t6A37低修飾導致線粒體mRNA翻譯過程中出現多種氨基酸錯誤摻入[1]
3 Osgepl1基因敲除小鼠線粒體基因組編碼蛋白質翻譯受損但是未對心臟產生顯著影響
通過構建Osgepl1全身敲除的小鼠（由賽業生物提供），研究人員重點研究了該模型小鼠的心臟功能。發現Osgepl1-KO小鼠心臟線粒體編碼的Mt-Cox2和Mt-Cox3的表達量顯著下降，然而即使在20月齡模型小鼠的心臟功能檢測中，這兩種線粒體編碼氧化磷酸化復合物IV蛋白質表達量的下調并未顯著影響小鼠的心臟線粒體氧化磷酸化復合物的組裝，心臟超聲顯示其射血分數、短軸收縮率以及每搏心輸出量未發生顯著變化，同時其壽命也未受到顯著影響。
Osgepl1基因敲除小鼠線粒體基因組編碼蛋白質翻譯受損但是未對心臟產生顯著影響[1]
研究結論
該研究首次發現了線粒體tRNA 37位t6A修飾缺失會導致mt-tRNAThr和mt-tRNALys上m1A9，m2G10修飾的異常升高及氨基酰化下降；同時發現該修飾的缺失導致其五種底物tRNA會錯誤地與mRNA配對使翻譯精確性下降。這些功能紊亂共同導致線粒體功能和結構的異常。但在動物層面上t6A修飾缺失未對小鼠心臟功能及壽命產生顯著影響。以上結果加深了人們對線粒體tRNA修飾的生物學功能的認識。
參考文獻：
[1]Yong Zhang, Jing-Bo Zhou, Yue Yin, En-Duo Wang, Xiao-Long Zhou, Multifaceted roles of t6A biogenesis in efficiency and fidelity of mitochondrial gene expression, Nucleic Acids Research, 2024;, gkae013, https://doi.org/10.1093/nar/gkae013
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S-CKO-15344
應用方向：
眼科,代謝,遺傳,肝臟,腎臟,罕見病
