牙髓間充質干細胞(dental pulp mesenchymal stem cells，DPMSCs)屬于被定義較晚的一種間充質干細胞類型，它從健康成人第三磨牙中發現，從此改變了脫落牙齒和拔除智齒作為口腔醫療廢棄物的固定標簽，并成為MSCs研究的主要來源，變廢為寶。

DPMSCs是一種具有高度增殖能力和多向分化潛能的間充質干細胞，具有來源豐富、取材安全方便、不涉及倫理學問題、免疫原性低等優點，在再生醫學領域取得了很大進展，具有廣闊的應用前景。

國內首個申報牙髓間充質干細胞的注射液的新藥臨床實驗在2020年8月獲得臨床默示許可，并在今年5月順利進入II期臨床^[2]。該注射液的有效成分是人牙髓間充質干細胞，臨床用于治療慢性牙周炎。
 

應用前景如此廣泛，取料獲取也不難的
牙髓間充質干細胞
應該如何獲得呢？

此前我們已經為大家介紹了一種取材方法
請隨我們往下看，
還有另兩條羅馬大道~

材料準備

· 組織樣本: 無齲齒的健康智齒或自然脫落的乳牙。
· 實驗試劑:OriCell^®PBS緩沖液(1X), OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基, OriCell^®胰蛋白酶細胞消化液（0.25%），OriCell^®I型膠原蛋白酶(0.1%) ，OriCell^®青霉素-鏈霉素溶液（100X）。
· 器具耗材：細胞培養皿，眼科鑷，牙科鉗，牙科錘。

牙髓間充質干細胞的獲得

1. 將0.1%的I型膠原酶預熱至37℃。
2. 將牙髓組織剪碎至1mm2大小，利用離心管收集牙髓組織，常溫條件下265g離心力，離心5min。
3. 棄上清，使用5mL的0.1% I型膠原酶重懸牙髓組織，置于37℃水浴中消化20min，期間每5min取出充分搖勻，或者有條件可以使用恒溫搖床進行消化。
4. 消化完成后加入等體積的完全培養基，完全混勻消化懸液和完全培養基。
5. 265g離心5min，棄上清，使用預熱的OriCell^®人牙髓間充質干細胞完全培養基重懸細胞，接種至培養皿中。
6. 接種完成后盡量不要移動培養皿，72h后觀察細胞狀態，之后視情況進行換液，待細胞匯集率達80%-90%，即可進行傳代。

注意事項
直接貼壁或者胰酶消化法均可獲得牙髓間充質干細胞，但是如果使用的實驗材料是乳牙，建議使用直接貼壁法，以增加細胞得率。因為乳牙牙髓非常脆弱及松軟，且組織較小，使用貼壁法可以盡量減少操作時間，避免步驟過多，牙髓組織有額外損失。

牙髓間充質干細胞的傳代
人牙髓間充質干細胞生長至80%-90%融合度時，就應該進行傳代。不可讓人牙髓間充質干細胞完全融合或者過度融合，否則會出現接觸抑制，嚴重影響細胞生長。

傳代操作
1. 將完全培養基、0.25%胰酶預熱至37℃。
2. 吸去培養液，用1×PBS洗滌細胞2-3次以去除殘留的血清，吸去PBS。
3. 加入適量0.25%胰酶，輕輕旋轉培養皿，使胰酶覆蓋細胞表面，消化1-2min，顯微鏡下可見細胞間隙增大、 變圓（以顯微鏡下所見為消化依據）。用手輕拍培養器皿的壁，當大約有80％細胞脫壁浮起時，立即加入2-3mL完全培養液終止消化。
注意：總的消化時間不可太長。因為對于間充質干細胞來說，其消化脫壁的時間應該較短，難以消化脫壁的細胞可能多數不是間充質干細胞，而是其他的雜細胞。
4. 將細胞移入離心管中，再向培養瓶中加入1×PBS洗1-2次，同樣轉移至離心管中。
5. 265g離心4min，吸去上清液后用2-3mL完全培養基重懸細胞。
6. 按照細胞量或按照2×10⁴個細胞/cm²的密度接種細胞。
7. 加入完全培養基，在 37℃、5%CO₂、95%相對濕度的培養箱中進行培養。
 

以上就是人牙髓間充質干細胞的提取和傳代方案啦，大家都學會了嗎？

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參考文獻
1. GRONTHOS S，MANKANI M，BRAHIM J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and invivo.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(25)：13625-13630.

2. 中源協和細胞基因工程股份有限公司關于參股子公司藥物進入Ⅱ期臨床試驗的公告（公告編號：2023-022，2023年5月25日）。