肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy, HCM）是最常見的遺傳性心肌病，發病率約為1/500，HCM以左心室不對稱增厚和舒張功能受損為特征，是心力衰竭和心源性猝死的主要原因。目前仍有很大比例HCM患者（56.10%）未確定致病基因。因此，發現新的致病基因為揭示HCM發病機制及診斷治療具有重要意義。
 

圖片來源：《Circulation》
（https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064489）

2月16日，空軍軍醫大學吳元明教授團隊在心血管領域頂尖雜志《Circulation》（IF 37.8）上發表題為“FARS2 Deficiency Causes Cardiomyopathy by Disrupting Mitochondrial Homeostasis and the Mitochondrial Quality Control System”的研究論文，該研究通過分析一例HCM患者家系和1141名HCM患者人群數據，鑒定得到了一個導致HCM的新致病基因——FARS2，通過建立多種FARS2基因缺陷動物和細胞模型，明確FARS2缺陷會直接導致心肌細胞肥大、心肌組織結構與功能受損，最終引發心力衰竭。該病理過程與FARS2參與的線粒體功能穩態維持密切相關。通過靶向線粒體穩態調控通路可以部分挽救由于FARS2缺陷導致的線粒體功能障礙及心功能損傷。該研究首次揭示了FARS2對心肌功能維持的關鍵作用，并為未來FARS2缺陷相關心肌病治療提供了思路。

空軍軍醫大學博士研究生李博文、高級實驗師劉芳芳為文章的第一作者，空軍軍醫大學基礎醫學院吳元明教授、陳琨講師、西京醫院超聲診斷科劉麗文教授為文章通訊作者。

研究材料
在這項研究中，作者采用Loxp-Cre系統構建心肌細胞特異性Fars2條件性敲除小鼠模型及Fars2條件性點突變小鼠模型（由賽業生物提供）以及腺相關病毒構建的基因過表達及敲減小鼠模型。

研究方法
在研究中采用了臨床遺傳學、細胞生物學、實驗動物學、分子生物學及生物信息學等研究方法。

技術路線
01 分析一例HCM患者家系，結合1141HCM患者測序數據，篩選并鑒定得到7個FARS2基因突變，并明確突變體導致蛋白功能缺陷
02 FARS2心肌組織特異性誘導性敲除小鼠及斑馬魚出現心肌細胞肥大、心力衰竭、壽命縮短等表型
03 03.FARS2缺陷導致小鼠心功能受損、心肌細胞線粒體功能受損表型
04 通過轉錄組測序等方法確定FARS2缺陷導致mt-tRNA^Phe合成、線粒體穩態調控及蛋白合成收到破壞
05 FARS2缺陷導致線粒體質量控制系統被破壞
06 通過干預線粒體質量控制系統可以挽救FARS2缺陷細胞模型的線粒體功能損傷表型
07 通過干預線粒體分裂通路可以挽救FARS2缺陷小鼠心肌功能及表型

研究結果

肥厚型心肌病中鑒定到的FARS2突變體的功能表征[1]

首先，作者在臨床收集了一個HCM家系，通過全外顯子測序及家系共分離分析明確FARS2 p.R415L為該家系的潛在致病突變。由于FARS2與心肌病之前的聯系尚未報道，作者進一步分析了1141個HCM患者突變數據，鑒定到了另外6個疾病相關FARS2基因突變。為了探索突變體的相關功能，作者利用分子對接模擬、mRNA、蛋白穩定性及線粒體定位分析，明確突變體導致蛋白穩態或線粒體定位能力受損，提示各突變體可能導致FARS2缺陷。此外，作者構建了小鼠組成型心肌細胞特異性FARS2 p.R415L點突變小鼠模型（由賽業生物提供），并發現FARS2 p.R415L點突變小鼠在4周齡出現了心室壁增厚等表型。進一步證實了FARS2 p.R415L點突變的潛在致病性。
 

FARS2缺陷會導致心肌細胞肥大、心力衰竭及猝死[1]

為了探究FARS2缺陷是否直接導致心肌病，作者構建了FARS2心肌細胞特異性誘導型敲除小鼠（icKO）。研究數據表明，FARS2缺陷導致小鼠生存期大大縮短，且與性別無關。誘導敲除后，心臟組織出現進行性重量增加、肥厚marker基因表達量增加、心肌纖維化輕微增加、心肌細胞增粗等表型。為了探究FARS2缺陷導致心肌病的物種保守性，作者構建了fars2缺陷斑馬魚模型，結果表明fars2缺陷導致斑馬魚心前充血增加、心力衰竭、心包水腫。
 

FARS2缺陷導致心肌和線粒體功能缺陷[1]

為了進一步明確FARS2缺陷所導致的心臟表型，作者對敲除3周（敲除早期）和敲除10周（敲除晚期）的小鼠進行了超聲心動圖檢測。結果提示FARS2缺陷導致小鼠心功能受損，且隨著時間延長進一步加重。透射電鏡結果顯示icKO小鼠出現線粒體碎片化、纖維水腫和肌絲紊亂，且線粒體內出現了“華夫餅”樣形態學重塑表型。此外，FARS2缺陷大鼠原代心肌細胞表現為有氧氧化能力大幅降低、糖酵解能力輕微增加，提示線粒體功能受損。
 

icKO心臟線粒體穩態和蛋白質合成功能缺陷[1]

作者通過轉錄組測序及進一步的驗證初步探索了FARS2缺陷導致肥厚型心肌病表型的可能分子機制，認為線粒體穩態在疾病發展過程中發揮著重要作用。通過KEGG及GO富集分析發現線粒體穩態相關通路顯著富集，結合前期的心臟表型及亞細胞線粒體形態改變，作者聚焦于線粒體相關自噬和線粒體動力學通路。首先，作者檢測了線粒體OXPHOs含量及mtDNA編碼蛋白含量，發現icKO晚期FARS2缺陷嚴重影響了mtDNA編碼基因的表達，進而影響了線粒體呼吸復合物含量，導致線粒體功能異常，具體體現在ATP含量的下降、活性氧水平的升高。而icKO早期這種變化并不顯著，與所觀察到心臟功能異常表型不一致，通過對mtDNA編碼基因轉錄本的檢測，作者認為icKO早期mtDNA編碼基因轉錄本代償性升高可能增加了線粒體內蛋白合成效率，進而觀察到OXPHOs蛋白含量沒有顯著改變。
 

FARS2缺陷擾亂了線粒體質量控制系統[1]

當線粒體功能受損時，細胞內擁有一個復雜的分子網絡來恢復線粒體穩態。那么，線粒體穩態調節通路相關分子在icKO早期和晚期發生了什么改變呢？線粒體穩態調節通路主要包括線粒體相關自噬、線粒體融合與分裂、線粒體生物合成等。首先，作者選擇從全細胞和線粒體兩個維度進行研究。通過檢測線粒體相關自噬通路關鍵分子的改變情況，作者觀察到在icKO早期，細胞內自噬流顯著增高，具體表現為LC3Ⅱ/Ⅰ升高、p62降低。作者猜測，細胞內自噬流增強主要是為了通過激活線粒體相關自噬清除受損線粒體。通過一系列的實驗驗證，作者認為FARS2缺陷后，線粒體相關自噬通路持續被激活，導致PINK1/Parkin/線粒體外膜蛋白泛素化增加，然而細胞后期缺少成熟的自噬泡，因此沒有足夠的自噬泡用于清除被泛素標記的線粒體外膜蛋白，最終導致線粒體穩態異常。

由于線粒體自噬通路需要線粒體經過分裂將受損部分線粒體分裂出去，因此，作者進一步觀察了FARS2缺陷后心肌細胞內線粒體動力學改變情況。從結果上來看，icKO晚期線粒體分裂蛋白DRP1在線粒體上的顯著募集、線粒體外膜融合蛋白MFN1及內膜融合蛋白OPA1的顯著降低均說明線粒體趨向于線粒體碎片化，這些結果與前期透射電鏡中觀察到的線粒體碎片化相一致。此外，組織線粒體免疫熒光染色也進一步驗證了這一結果。而在icKO早期，這些變化并不明顯，這可能是由于分裂后的線粒體通過自噬被及時清除所導致的。
 

3-MA和Mdivi-1減輕了大鼠原代心室肌細胞中FARS2缺陷誘導的線粒體失穩態[1]

為了進一步明確自噬和線粒體分裂在FARS2缺陷所導致的心肌細胞線粒體失穩中的重要作用并尋找其具體分子機制，作者利用自噬抑制劑3-MA和線粒體分裂抑制劑Mdivi-1處理大鼠原代心肌細胞。首先，3-MA和Mdivi-1處理后抑制了由于FARS2缺陷所導致的線粒體自噬通路，3-MA處理后顯著降低了DRP1的S616和S637的磷酸化及FIS1含量，兩種抑制劑處理后恢復了由于FARS2缺陷所導致的線粒體外膜融合蛋白MFN1及MFN2含量的降低。對線粒體表型進行進一步檢測，結果顯示兩種試劑處理后部分挽救了線粒體碎片化結局。令人興奮的是抑制自噬和線粒體分裂后，部分挽救了由于FARS2缺陷導致線粒體功能損傷的表型，具體表現為線粒體OXPHOs含量部分恢復，ATP升高、活性氧降低、線粒體膜極性恢復、線粒體DNA拷貝數升高、線粒體含量升高等。
 

AAV9介導的Drp1敲減或Mfn1過表達可減輕Fars2缺陷引起的心肌功能障礙，并延長小鼠的壽命[1]

為了明確線粒體分裂及線粒體相關自噬在FARS2缺陷導致線粒體功能障礙中的作用及尋找可能的治療策略，作者在體內使用了AAV9介導的Drp1-shRNA和Mfn1的過表達病毒，通過心肌點注射的方式對小鼠進行表型挽救。結果顯示，Drp1的敲減和Mfn1的過表達均可以部分緩解疾病的進展，敲除后10周的心肌肥厚程度輕于對照組（icKO+AAV9-Ctrl），表現為心臟重量較輕、心功能受損程度較輕。并且Mfn1過表達組的作用要優于Drp1敲減組。另外，兩種不同的策略均延長了小鼠的生存期，并且Mfn1過表達組的生存期要更長一些。綜合這些結果表明，通過干預線粒體動力學可以部分挽救由于FARS2缺陷所導致的小鼠心肌肥厚，并顯著延長了小鼠的生存期。進一步證明了FARS2缺陷所導致的線粒體碎片化在心肌病理學進程中的作用，并建立了一種可能的基因治療策略。

研究結論

本研究首次報道FARS2是遺傳性心肌病的潛在致病基因。FARS2缺陷通過破壞線粒體穩態和擾亂線粒體質量控制系統導致心肌肥厚。該研究不僅揭示了FARS2在心臟中的生物學功能，而且為線粒體氨酰tRNA合成酶相關心肌病的分子診斷、預防和FARS2相關心肌病的治療提供了新的見解。

原文檢索：
[1]Li B, Liu F, Chen X, et al. FARS2 Deficiency Causes Cardiomyopathy by Disrupting Mitochondrial Homeostasis and the Mitochondrial Quality Control System[J]. Circulation, 2024.
 

Fars2 KO小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Fars2^em1/Cya
產品編號：
S-KO-13224
應用方向：
代謝,內分泌,心血管,眼科,肝臟,腎臟,罕見病
 

Fars2 flox小鼠

品系名稱：
C57BL/6JCya-Fars2^em1flox/Cya
產品編號：
S-CKO-14699
應用方向：
代謝,內分泌,心血管,眼科,肝臟,腎臟,罕見病