牙周炎、類風濕關節炎等炎癥性疾病發生時，巨噬細胞被募集并極化為M1促炎表型。這些長期活動的M1巨噬細胞隨后產生高水平的NO、活性氧和促炎細胞因子，導致持續的炎癥反應。促炎細胞因子可促進成骨細胞產生RANKL的受體激活劑，導致破骨細胞過度形成，從而破壞骨穩態。

間充質干細胞（MSCs）因具有強大的免疫調節能力而被廣泛用于各種炎癥性疾病的治療，包括牙周炎。越來越多的證據表明，MSCs的治療效果主要歸因于其分泌的旁分泌因子，其中最關鍵的是細胞外囊泡（EV），包括外泌體（EXO）、小細胞外囊泡（sEV）。有研究表明，MSC-sEV在免疫調節和誘導組織修復再生等治療效果上與MSC類似，且在安全性、存儲和給藥方面比MSC療法更具優勢，因此被認為是一種大有潛力的治療方法。

牙髓干細胞（DPSCs）是從成人牙髓中分離出來的一種間充質干細胞，其容易獲得，且不會引起任何倫理問題。據報道，牙髓干細胞來源小細胞外囊泡（DPSC-sEV)顯示出比骨髓間充質干細胞來源小細胞外囊泡（BMSC-sEV）更強的免疫調節作用。不過，DPSC-sEV能否直接抑制巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的生成，目前還是一個未知數。此外，體外培養的MSCs通常暴露在常氧（21% O₂）條件下，而體內相當一部分MSCs存在于低氧環境中（2%-8%），那么在低氧條件下產生的DPSC-sEV是否能發揮更好的治療效果？

為此，中山大學附屬口腔醫院的研究團隊發現，低氧誘導的DPSC-sEV通過調節巨噬細胞極化和破骨細胞生成來改善炎癥性骨溶解。這項成果于近日發表在《Bioactive Materials》雜志上，有望為骨髓炎、牙周炎、類風濕關節炎等常見病的治療帶來一種新策略。
 

研究材料與方法
研究人員從SD大鼠上頜中切牙的牙髓中分離出DPSCs，并鑒定了DPSCs的成骨分化和成脂分化能力（OriCell^®MSC成脂誘導分化試劑盒、OriCell^®茜素紅染色液、OriCell^®油紅O染色液等產品為該項研究助力）。

之后，研究人員從DPSCs中分離出小細胞外囊泡（sEV），并開展了一系列的分析。在體內研究中，使用了LPS誘導的小鼠顱骨炎性骨吸收模型，體外研究則使用了RAW264.7巨噬細胞。

技術路線
從DPSCs中分離出sEV，發現低氧誘導了DPSCs的sEV釋放
Hypo-sEV誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成，從而改善了LPS誘導的炎癥性骨吸收
通過miRNA表達譜分析等實驗，發現Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導的
miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達，來調節巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的形成

研究結果
01 Hypo-sEV促進巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成
在分離出DPSCs后，研究人員經過流式分析和免疫熒光分析，確認培養的DPSCs具有MSC的間質表型，并具備多潛能分化能力。隨后，他們通過超速離心法從常氧（normoxic conditions）和低氧(hypoxic conditions)條件下培養的DPSCs上清液中分離出sEV，分別命名為Nor-sEV和Hypo-sEV。結果發現，這兩種sEV都表現出典型的EV特征，但Hypo-sEV的濃度更高，且蛋白質濃度也明顯更高。而且，通過sEV蛋白標志物分析，發現低氧明顯增加誘導了DPSCs釋放sEV。

為了比較這兩種sEV對炎癥性骨溶解的治療效果，研究人員使用了LPS誘導的小鼠炎癥性骨吸收模型。通過micro-CT掃描和組織學檢查評估，他們發現Nor-sEV對LPS誘導的骨溶解未能表現出明顯的治療效果。相反，Hypo-sEV挽救了小鼠顱骨基質的炎癥性骨溶解，即提高了BV/TV值，并減少了骨侵蝕面積（圖1）。這些結果表明，Hypo-sEV明顯改善了LPS誘導的體內炎癥性骨吸收。
 

Hypo-sEV在體內抑制LPS誘導的炎癥性骨吸收^[1]

由于巨噬細胞從M1到M2的表型轉變可促進骨修復，故研究人員接著分析了Hypo-sEV是否可促進體內的巨噬細胞M2極化。LPS導致CD68⁺iNOS⁺巨噬細胞（M1表型）數量增加，但Hypo-sEV和Nor-sEV的加入使得顱骨基質中出現了更多的CD68⁺Arg1⁺巨噬細胞（M2表型），且Hypo-sEV處理后的M1巨噬細胞更少，M2巨噬細胞更多。與Nor-sEV相比，Hypo-sEV明顯抑制IL-1β的表達，促進IL-10和Arg1的表達。由此可見，Hypo-sEV可以抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應，并誘導巨噬細胞M2極化。

炎癥性骨吸收是由破骨細胞的過度生成引起的，因此研究人員還研究了Hypo-sEV是否能抑制體內破骨細胞的生成。他們發現，Nor-sEV和Hypo-sEV都減少了LPS誘導的破骨細胞（TRAP陽性）數量，且Hypo-sEV組的破骨細胞數量低于Nor-sEV組。體外培養實驗也表明，這兩種sEV抑制了RANKL誘導的破骨細胞分化，且Hypo-sEV組的抑制效果優于Nor-sEV組。這些數據顯示，Hypo-sEV在體內和體外直接抑制了破骨細胞生成。

02 Hypo-sEV通過上調miR-210-3p表達而發揮作用
為了進一步分析這背后的分子機制，研究人員決定從miRNA研究入手。他們利用新一代測序分析了Nor-sEV和Hypo-sEV的miRNA表達譜。結果發現，與Nor-sEV相比，Hypo-sEV中有45個miRNA上調，64個miRNA下調。在重點關注與巨噬細胞炎癥反應或破骨細胞分化有關的miRNA后，他們還發現Hypo-sEV中的miR-7578、miR-187-3p和miR-210-3p水平相對于Nor-sEV升高。后續分析顯示，miR-210-3p在介導Hypo-sEV的治療效果方面發揮了關鍵作用。

接著，通過對RAW264.7細胞與兩種sEV的共培養分析，進一步發現了Hypo-sEV可以將miR-210-3p遞送到巨噬細胞和破骨細胞中。miR-210-3p抑制劑提高了促炎細胞因子和iNOS的表達，同時降低了IL-10和Arg1的表達，減弱了Hypo-sEV誘導巨噬細胞M2極化的能力。此外，miR-210-3p抑制劑也部分降低了Hypo-sEV抑制破骨細胞形成的能力以及破骨細胞生成相關基因的表達（圖2）。這些結果表明，Hypo-sEV通過上調miR-210-3p表達而誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成。
 

Hypo-sEV在體外通過遞送miR-210-3p而誘導巨噬細胞M2極化并抑制破骨細胞生成^[1]

之后，實驗轉移到小鼠模型上繼續進行。為了進一步確認Hypo-sEV的治療效果是由miR-210-3p介導的，研究人員在LPS誘導的炎癥性骨吸收模型中使用了miRNA抑制劑antagomir-210-3p。結果顯示，antagomir-210-3p明顯消除了Hypo-sEV的治療作用。而且與對照相比，antagomir-210-3p的加入導致M1型巨噬細胞增加，M2型巨噬細胞減少。這些結果證實。miR-210-3p通過誘導巨噬細胞M2極化和抑制破骨細胞生成而明顯改善了LPS誘導的炎癥性骨溶解。

后續的分析發現，miR-210-3p直接靶向了NF-κB1的3′UTR，而NF-κB通路的激活對巨噬細胞M1極化和破骨細胞生成至關重要。miR-210-3p通過抑制NF-κB1 p105表達來調節巨噬細胞的炎癥反應和破骨細胞的形成。

結論

miR-210-3p抑制LPS誘導的炎癥性骨吸收的示意圖^[1]

這項研究表明，低氧預處理不僅誘導了DPSC-sEV的分泌，還增強了DPSC-sEV介導的對LPS誘導的骨溶解的治療效果。其中，miR-210-3p通過誘導巨噬細胞M2極化和抑制破骨細胞生成來保護骨骼。

因此，低氧誘導的DPSC-sEV和miR-210-3p的這種“一石二鳥”作用有助于開發新策略來治療炎癥性或感染性骨溶解。

原文檢索
[1]Jun Tian, Weiyang Chen, Yuhua Xiong, et al. Small extracellular vesicles derived from hypoxic preconditioned dental pulp stem cells ameliorate inflammatory osteolysis by modulating macrophage polarization and osteoclastogenesis. Bioactive Materials, Volume 22, 2023, Pages 326-342, ISSN 2452-199X. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.10.001.