血液系統負責氧氣和營養的輸送、代謝產物的排出、免疫細胞的運輸和凝血，和免疫系統共同維持機體的健康和免疫防御。血液系統基因異常可能導致一系列免疫或血液相關的罕見疾病。

除了傳統的化療和造血干細胞移植等治療方法外，科學家們一直在尋找新的治療血液罕見病的方法。近年來，小鼠模型為免疫基因治療帶來了新思路，成為了研究血液罕見病的新方向。今天我們就來講講幾個罕見的血液系統疾病及其相關基因敲除小鼠模型。
 

血液系統是多種血液細胞和免疫細胞生成、成熟和運輸的場所^[1]

維生素B12選擇性吸收障礙綜合征（IGS1）

維生素B12選擇性吸收障礙綜合征（IGS1）是一種由于維生素B12水平低引起的疾病。維生素B12參與紅細胞形成和大腦及中樞神經系統維護，但人體只能從食物中獲取。IGS主要癥狀為巨幼紅細胞性貧血，一半以上患者存在尿蛋白現象。血液系統異常還會導致生長發育遲緩、胃腸道或呼吸道感染等癥狀，以及肌張力減弱、運動障礙、發育遲緩或混亂等神經系統缺陷，并伴有泌尿道異常^[2]。目前治療主要通過補充維生素B12，可短期內改善貧血癥狀并緩解神經系統癥狀，但無法根治。

CUBN基因編碼的Cubilin蛋白參與從食物中攝取維生素B12到人體內的過程。Cubilin主要存在于腎細胞和小腸細胞上，通過與Amnionless蛋白附著固定在細胞外膜。Cubilin與通過小腸和腎臟的維生素B12結合形成復合物，再被Amnionless蛋白轉移到腸細胞內并釋放到血液中運輸到全身。CUBN突變導致Cubilin功能障礙，無法與維生素B12形成復合物，影響其吸收^[3]。在小鼠中，Cubn基因全身性敲除會導致胚胎期致死，胚胎發育遲緩。雖然突變體胚胎中形成了尿囊和心臟等中胚層結構，但其他中胚層組織發育異常或缺失^[4]。
 

Cubn-KO小鼠胚胎發育遲緩且缺乏體細胞^[4]

Cubn基因外胚層條件性敲除小鼠可存活且發育大體正常，但腎臟近曲小管細胞對維生素B12吸收存在明顯缺陷，導致血漿中維生素B12含量急劇下降并出現部分血液系統異常。此外，該小鼠體內轉鐵蛋白和白蛋白等巨球蛋白排泄增加，導致蛋白尿產生^[5]。
 

Cubn-cKO小鼠缺乏對維生素B12的吸收^[5]

除CUBN外，AMN也是IGS致病基因之一。AMN基因編碼的Amnionless蛋白將Cubilin-維生素B12復合物轉移到腸細胞內并釋放到血液中運輸到全身。此外，Amnionless蛋白還與血漿脂蛋白的組裝、重塑和清除等過程相關。AMN基因突變導致Cubilin-維生素B12復合物無法附著在小腸和腎臟細胞上，影響其吸收。與Cubn-KO小鼠相似，Amn基因敲除小鼠沒有羊膜，胚胎發育受損嚴重，存在胚胎致死現象且缺乏產生軀干的中胚層^[6-7]。
 

Amn全身性敲除小鼠存在嚴重胚胎發育缺陷^[7]

此外，通過胚胎干細胞（ES）技術構建Amn缺失小鼠嵌合體可形成解剖學正常的腎臟和腸道，但小鼠表現出選擇性蛋白尿。在Amn缺失小鼠組織中，Cubn未能正確定位到細胞表面，Amn缺失的胚胎和成年小鼠同樣表現出對Cubn配體的選擇性蛋白尿^[8]。
 

Amn缺失嵌合體小鼠缺乏正確的Cubn細胞定位 ^[8]

紅細胞增多癥&貧血
紅細胞是人體內含量最多的血細胞，主要功能是攜帶氧氣從肺部運輸到身體各組織和器官，以及將二氧化碳從組織運輸回肺部呼出。紅細胞從造血干細胞生成成熟的過程受多種細胞因子密切調控，其中紅細胞生成素（EPO）最為重要。EPO與紅細胞生成素受體（EPOR）結合激活受體，刺激多種信號通路，導致紅細胞形成和成熟。紅細胞生成異常會導致貧血、地中海貧血和紅細胞增多癥等疾病。EPOR和EPO是兩個重要的致病基因，至少16種EPOR基因突變會導致家族性紅細胞增多癥^[9]。大多數EPOR基因突變導致生成異常短的紅細胞生成素受體，使其與EPO結合后長時間保持異常激活狀態，過度活躍的受體即使不需要紅細胞也會發出生產信號，導致血液中紅細胞過多。此外，EPOR完全缺失的突變也會導致貧血。

EPO和EPOR除促進紅細胞生成外，還發揮促進心臟和中樞神經系統發育、改善學習和記憶等非紅細胞生成功能。因此，在小鼠中，Epor全身性敲除小鼠出現其它系統障礙，表現出胚胎發育障礙或異常等表型，并在胚胎第11-12.5天死于子宮內，伴有嚴重貧血。因此，Epor純合敲除小鼠不適合紅細胞增多癥研究，但可用于胚胎發育、原始造血調控和貧血方面研究^[10]。
 

Epor-KO小鼠表現為異常白色胚胎和血細胞減少表型^[10]

與Epor全身性敲除小鼠相似，Epo全身性敲除小鼠同樣胚胎致死，死亡前胚胎中存在嚴重造血缺陷，表現為胎肝中紅系祖細胞數量嚴重減少^[11]。得益于基因編輯技術，可通過Cre/Loxp系統構建Epo條件性敲除小鼠，這類小鼠可存活到成年并在誘導后出現晚發型貧血表型。Cre重組酶活性表達后，Epo雜合敲除小鼠（EPO KO/flox）在3周內發展成中度至重度貧血^[12]。
 

Epo條件性敲除小鼠Epo表達減少且紅系造血存在缺陷^[12]

血小板無力癥（GT）
血小板無力癥（GT）是一種先天性凝血異常疾病，患者受傷時血液無法正常凝結，造成血流不止。這種常染色隱性遺傳病臨床上常見自發性粘膜出血，重者可內臟出血。治療主要依靠預防、保護、止血、血小板輸注，重癥患者需造血干細胞移植治療。GT由血小板膜糖蛋白GPⅡb（CD41/Itgb2b）和/或GPⅢa（CD61/Itgb3）數量或質量異常導致，造成血小板對各種生理性誘導劑聚集大大減低或缺失。GPⅡb和GPⅢa基因分別編碼血小板上的糖蛋白Ⅱb和Ⅲa，兩種糖蛋白結合形成GPⅡb/Ⅲa復合物，也稱整合素αⅡbβ31。該復合體是纖維蛋白原和von Willebrand因子的受體，有助于血小板激活^[13]。

Itgb3（CD61）編碼的β3整合素在血小板聚集和血栓形成以及著床、胎盤形成、血管生成、骨重塑和腫瘤進展等功能中起重要作用。Itgb3基因敲除小鼠可存活和生育，表現出GT所有主要特征，包括血小板聚集和凝塊收縮缺陷、出血時間延長、皮膚和胃腸道出血，還有概率出現胎盤缺陷導致胎兒死亡、產后出血導致貧血和存活率降低等情況^[14]。同時也存在血小板計數減少、脾臟增大和髓外造血等非GT患者表型^[15]。
 

Itgb3-KO小鼠呈現自發出血和出血時間延長等GT樣表型^[15]

Itga2b（CD41）基因編碼的整合素αIIb是經典血小板標志物，與整合素β3形成異二聚體，與纖連蛋白、纖維蛋白原、玻連蛋白和血管性血友病因子結合，發揮與Itgb3相似作用。但值得注意的是，Itga2b也是胚胎干細胞體外分化過程中第一個血液特異性標志物，在早期胚胎所有造血干細胞和祖細胞上表達。因此，Itga2b基因敲除小鼠除表現GT樣表型外，還表現出多系造血缺陷和造血干細胞靜止性和存活率降低等表型^[16]。
 

Itga2b（CD41）-KO小鼠全血細胞減少，造血干細胞凋亡增加^[16]

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