1986年，Orthoclone OKT3^®的獲批標志著單克隆抗體 (monoclonal antibody, mAb) 首次應用于臨床。自 Orthoclone OKT3^®獲批以來的30多年里，70多種抗體被批準用于治療或診斷，占整個生物治療市場份額50%以上。這類治療藥物之所以取得成功，得益于相較小分子化合物的關鍵優勢，如較高的靶向特異性和極低的基因毒性。然而，抗體的臨床前開發也面臨著某些特有難題�？贵w具有高度的物種特異性，不僅表現在與靶標結合的可變區，也表現在延長抗體半衰期所需的Fc區。

藥物開發人員常利用細胞生成千上萬種抗體，然后從中選擇與靶標親和力最強的抗體 (Singh et al., 2018)。根據相互作用的位點，抗體可阻斷或激活目標蛋白，從而促進目標蛋白的清除，或者誘導針對表達目標蛋白細胞的免疫反應。此外，抗體還可以與藥物或毒素偶聯，增加特定部位的局部藥物濃度。與其他在血清中半衰期僅有數小時的蛋白相比，抗體在血液循環中十分穩定。免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG) 是治療開發過程中最常使用的抗體類型，其半衰期約為21天。 IgG半衰期較長是因為 IgG 與新生兒 Fc 受體 (Fc receptor, FcRn；又稱Fc gamma receptor and transporter, FCGRT) 之間存在相互作用。

本文中，我們將討論抗體類治療藥物研發中的一些難題，包括評估藥代動力學特征、選擇有療效的候選抗體分子以及確定適合的給藥劑量。
 
通過藥代動力學評估改善臨床相關性
 
單克隆抗體，特別是IgG類抗體，其半衰期顯著長于其他分子，同時具有較高的靶向特異性。這兩項特征使IgG mAb 成為研發治療藥物的理想之選。
 
延長治療性抗體的半衰期能夠提高療效、減少患者的治療次數，從而降低患者的治療和用藥成本。在發現具有所需特異性的治療性抗體后，研發人員通常會對潛在的候選抗體進行優化，提高Fc與FcRn的親和力。由于缺乏可靠的實驗工具來預測患者體內抗體的半衰期，這一過程往往困難重重。
 
使用小鼠模型預測候選治療性抗體藥代動力學(PK)數據的主要難點在于，不同物種對免疫球蛋白的處理方式不同。在哺乳動物中，大多數血液循環中的蛋白質會被內皮細胞和單核細胞持續攝取，并通過內體進入溶酶體進行降解。內體pH降低，從而為蛋白質進入溶酶體降解做準備。在該過程中，IgG蛋白會通過其Fc片段與跨膜受體FcRn相結合，從而避免降解。之后，FcRn-IgG復合物會重新定位于質膜，并將IgG釋放回血清中。因此，相較于其他蛋白質以及其他抗體類型抗體(IgA 、 IgE 和 IgM)， IgG的半衰期顯著延長。但是，人源IgG與人源或鼠源FcRn的相對親和力差異極大，這使得野生型小鼠很難用作預測人類患者PK的模型。
 
抗體半衰期可能受到多種因素的影響，包括pH值、FcRn結合域或可變區的修飾、各種接頭(linker)的使用以及有效荷載的類型(如抗體-藥物偶聯物)。因此，一組不同的治療抗體需要進行PK表征，以便選出最理想的候選抗體分子。
 
人源IgG-FcRn相互作用的親和力可以使用細胞結合試驗或表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance）等經濟有效的體外方法進行快速定量。最終需要獲得半衰期、清除率 (clearance, CL) 和曲線下面積 (area-under-the-curve, AUC) 等臨床相關PK值。通常情況下，體內PK測定方法為，通過靜脈將候選抗體注射入動物模型中，隨后幾天內測定血清中的抗體濃度。最后，將清除率和半衰期值轉換為患者體內的藥代動力學估算值。
 
直到數年之前，現有動物模型在準確測定人源抗體的PK方面仍存在很大的局限性。例如，標準嚙齒類動物模型相對廉價，且便于進行治療性候選IgG的半衰期檢測。但是，使用標準嚙齒類動物模型存在缺點，即小鼠源和大鼠源FcRn在與人源IgG結合時，其親和力與人源FcRn存在較大差異，這導致獲得的半衰期數據并不準確 (Ober et al., 2001)。因此，當使用野生型小鼠時，半衰期結果可能具有高度變異性，并且無法獲得臨床相關數據。出于Fc-FcRn結合的物種相似性考慮，非人靈長類動物可以合理準確地預測人源抗體在患者體內的PK；但是由于倫理和成本方面的原因，在藥物開發的早期階段將其用于篩選并不可行。
 
改善臨床相關性、降低對非人靈長類動物依賴性的潛在解決方案之一為——使用經過基因修飾的小鼠模型。為了解決因缺乏臨床前模型而難以準確預測治療藥物半衰期的問題，杰克森實驗室的科學家Derry Roopenian博士開發了一種特殊小鼠模型。該小鼠缺乏內源性小鼠FcRn基因，并攜帶人的FCGRT序列，因此僅表達人源FcRn蛋白 (Proetzel and Roopenian, 2014)。人源化FcRn小鼠模型B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(FCGRT)32Dcr/ DcrJ (014565)（又稱“Tg32”），和B6.Cg-Fcgrt^tm1DcrTg(CAG-FCGRT)276Dcr/ DcrJ (004919)（又稱“Tg276”）可用于預測 IgG抗體在人體內的PK，其準確性可媲美非人靈長類動物。此外，小鼠之間的變異性極小，因此每項研究所需的動物數量也較少。
 
就PK結果而言，已獲得臨床批準的治療性抗體在人源化FcRn Tg32小鼠中的結果與臨床患者觀察到數據顯著相關——這可能是因為Tg(FCGRT)32Dcr由人啟動子和增強子調控表達。當對于多種人源IgG治療藥物的PK特征進行大規模比較時，這些藥物在人類患者和非人靈長類動物以及Tg32小鼠中的半衰期和清除率范圍非常接近。盡管各藥物在Tg32小鼠中的半衰期較短，但從最短到最長的半衰期順序與臨床患者觀察到的數據高度相關，因此能夠通過異速放大法將Tg32小鼠中的藥物清除率和半衰期轉換為人類患者中的藥代動力學數據。
 
 
一種避免出現抗藥抗體的分析方案
 
值得注意的是，許多人源化FcRn轉基因模型具有正常的小鼠免疫系統。因此，研究中的人源抗體有可能引發抗藥抗體 (antidrug antibody, ADA) 反應。出現ADA后（通常為給藥后5 - 10天），人源IgG的半衰期將喪失或嚴重縮短，致使PK數據難以解釋。如果僅有少數小鼠出現ADA，則可能需要舍棄受影響動物的數據。
 
在某些情況下，實驗組的大多數動物都出現ADA反應，這會影響PK評估。如果擔心候選治療藥物可能導致ADA，或是需要徹底避免ADA發生，可以考慮選擇免疫缺陷背景的人源化FcRn小鼠模型。杰克森實驗室的科學家已將Prkdc^scid基因回交到Tg32小鼠中，使其具有免疫缺陷（018441；B6.Cg-Fcgrt_tm1Dcr Prkdc^scid Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ）。由于產生成熟B細胞需要Prkdc基因， scid突變小鼠無法產生抗體，從而排除了產生ADA的可能性 (Myzithras et al., 2017)。值得注意的是，由于內皮細胞和單核細胞是FcRn 介導再循環的主要場所，而scid突變并不會影響上述細胞的數量和功能，因此在這些模型中，免疫缺陷并不會影響PK相關數據。
 
為您的候選藥物選擇適合的給藥劑量
 
抗體的使用已經解決了有關藥物毒性的諸多問題�？贵w的固有特異性使脫靶效應的可能性顯著降低，并且抗體也不可能轉化為毒性代謝產物�？贵w介導的毒性主要源自非治療部位的抗原表達，以及免疫調節抗體介導的免疫系統過度活化 (Brennen et al., 2010)。對于這兩種情況，候選治療藥物的適當劑量能夠有助于預防和限制不良反應。然而，如果無法獲得用于預測人體中抗體PK的準確的臨床前數據，在設計臨床研究時設定治療劑量就十分困難。在許多情況下，需要在臨床試驗中進行劑量遞增研究，但這樣會降低治療效果，或增加出現副作用的可能性。
 
可使用杰克森實驗室人源化FcRn Tg32小鼠對抗體PK參數進行準確的臨床前評估，該小鼠具有人源FCGRT生理性表達模式 (Latvala et al., 2017)。在已有治療靶標的情況下，Tg32小鼠還可以用于評估藥效學研究中的劑量譜，從而縮小疾病治療模型中的最佳劑量。這些數據可用于支持治療性抗體臨床給藥劑量的相關決策。利用通過Tg32小鼠獲得的PK參數及預測性異速放大獲得的人類PK參數 (Betts et al., 2018)，臨床醫生可以估算達到預期治療效果所需要的最佳劑量范圍，從而減少在臨床試驗期間使用具有潛在風險的劑量遞增研究。
 
白蛋白載體的藥代動力學分析
 
白蛋白是僅有的另一種能夠在酸性pH條件下與FcRn上獨特位點相結合的天然配體。與IgG類似，白蛋白可避免被溶酶體降解，其在人體內的半衰期為21天。因此，可以將短效治療藥物與白蛋白偶聯，以延長治療藥物的半衰期并增加暴露量，同時降低給藥頻率。
 
使用人源化FcRn Tg32小鼠 (014565) 進行人白蛋白臨床前PK建模的挑戰依舊是物種間親和力的差異。小鼠源IgG對人源FcRn沒有明顯的親和力，但小鼠白蛋白對人源FcRn 的親和力卻遠高于人白蛋白。由于小鼠白蛋白對FcRn的競爭結合作用過強，導致在Tg32小鼠中人白蛋白的半衰期縮短。為使Tg32小鼠模型能夠用于人白蛋白PK分析，杰克森實驗室對其進行優化，靶向小鼠白蛋白基因構建了B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Alb ^em12MVW Fcgrt^tm1Dcr/MvwJ (025201) 小鼠，又稱“Tg32 Alb KO”小鼠。Tg32 Alb KO 小鼠中，人白蛋白的半衰期為14 - 16天，這與人體中半衰期接近。此外，與利用Fc變體改善候選治療性IgG的PK類似，白蛋白變體也可以用于改善FcRn親和力和PK。為了避免白蛋白-藥物偶聯或白蛋白親和力變體導致ADA，科學家將Prkdc^scid基因移至Tg32 Alb KO小鼠，構建出具有免疫缺陷的小鼠模型（031644；B6.Cg-Tg(FCGRT)32Dcr Alb ^em12MVW Fcgrt^tm1Dcr Prkdc^scid/J），它可用于白蛋白PK分析。
 
hFcRn 模型開發前景
 
NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjt/SzJ (005557) 又稱NSG小鼠。經CD34+細胞人源化以提供人源免疫應答，并將患者源性異種移植物 (Patient Derived Xenografts, PDX) 植入NSG小鼠，已成為開發用于治療癌癥的免疫治療抗體所需的重要模型。NSG小鼠攜帶小鼠源FcRn，因此使用該小鼠模型評估人源IgG治療藥物時，雖能較好地反映療效，但無法理想地反映人類PK。現已通過增加Tg32對NSG小鼠進行改善，使其FcRn“人源化”，即 NOD.Cg-Fcgrt^tm1Dcr Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjt Tg(FCGRT)32Dcr/J (028615)，又稱“NSG Tg32”。但是，由于NSG和NSG Tg32小鼠表達特有的高親和力Fcγ受體（FcγRI 和 FcγRIV），人源IgG在這兩種小鼠體內的半衰期仍較短。在與人源IgG的結合能力方面，Fcγ受體遠超FcRn，它就像水槽一樣將人源IgG從循環中清除 (Li et al., 2019)。作為改善方案，JAX也正在積極地對NSG Tg32小鼠進行基因工程改造，使其不表達Fcγ受體。
 
 
加速前沿療法進入臨床轉化
 
抗體藥代動力學的早期臨床前評估結果會影響治療藥物開發的多個方面。人源化FcRn轉基因小鼠模型的引入，為研究人員在藥物開發早期選擇具有最佳PK的抗體提供了新工具。反之，通過將資源集中于最有潛力的候選治療藥物上，藥物開發人員可以提高其產品開發成功率，并更快地將有效的抗體療法推向臨床應用。
 
杰克森實驗室的hFcRn小鼠模型平臺能夠模擬人源IgG特定的生理學特征，并為藥物開發早期階段中評估候選治療性抗體的PK提供了理想的模型平臺。此外，這些模型為預測候選治療性抗體和Fc變體在患者中的PK數據提供了一種可靠有效的方法，并且可以節省時間和成本。
 
杰克森實驗室治療性抗體評估服務可提供這種獨特的hFcRn小鼠模型相關抗體評估服務研究人員也曾直接參與上述模型的開發和早期表征工作。杰克森實驗室的服務產品憑借豐富的經驗積累，能夠從研究設計到實施給予全方位的優質指導，獲得快速且經濟有效的IgG治療藥物評估，幫助客戶獲得與醫學轉化相關的準確的藥代動力學數據，從而確定最有可能應用于臨床的治療性分子。
 
 
推薦資源
 
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