LRP3基因敲除小鼠在膽固醇代謝異常導致骨關節炎機制研究中的應用
骨關節炎（OA）是一種常見的關節疾病，臨床表現為關節疼痛、活動受限和關節畸形等，嚴重影響患者的工作能力和生活質量。盡管這種疾病的發病率高，但其病因仍不清楚。之前的一些研究發現，骨關節炎與一些患者的高膽固醇水平有關，表明很可能存在一種代謝性骨關節炎表型。不過，膽固醇代謝及其相關基因如何參與骨關節炎的發病機制，目前還知之甚少。
近日，北京大學第三醫院運動醫學科敖英芳教授和胡曉青研究員領導的研究團隊深入探索了膽固醇代謝異常導致骨關節炎的機制。這項研究成果于2022年11月21日發表在《Nature Communications》雜志上，有助于開發治療骨關節炎的新型療法。
圖片來源：《Nature Communications》
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員收集了多例骨關節炎患者的組織樣本，并使用了前交叉韌帶切斷術（ACLT）誘導的鼠類骨關節炎模型。在研究LRP3的功能時，他們使用了敲低和過表達LRP3的慢病毒載體，以及LRP3基因敲除小鼠（由賽業生物提供，產品編號：S-KO-10153）。他們還通過番紅O和甲苯胺藍染色來觀察軟骨形態，并通過IHC染色和免疫印跡分析來研究相關基因的表達。
技術路線
01 探索高膽固醇與骨關節炎軟骨退變的關系
02 發現膽固醇代謝相關基因LRP3的表達在骨關節炎發展過程中下降
03 通過基因敲除和過表達分析確定LRP3在骨關節炎中的功能
04 通過RNA測序和通路分析確定LRP3的下游分子靶點
研究結果
1.LRP3的表達在骨關節炎發展過程中下降
研究人員首先收集了100例接受全膝關節置換術（TKA）的骨關節炎患者及91例非骨關節炎患者的臨床數據。他們發現，骨關節炎患者的總膽固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）明顯更高，表明高脂血癥與骨關節炎發展之間可能存在關聯。此外，與常規飲食相比，高膽固醇飲食會誘導小鼠模型發生更嚴重的軟骨退變。
接下來，研究人員對兩種飲食喂養的小鼠的RNA測序結果進行了全面篩選，發現LDL受體相關蛋白（LRP）家族的表達發生了顯著變化（圖1）。LRP家族是一組進化上保守的細胞表面受體，參與了膽固醇代謝的調節。具體來說，作為LRP家族中變化最明顯的成員，在外源性膽固醇刺激后，LRP3在軟骨細胞中的表達（mRNA和蛋白質水平）均顯著下降，當炎癥因子與膽固醇共同作用時，變化趨勢更加明顯。
高膽固醇導致LRP3在軟骨中的表達下調[1]
為了進一步闡明LRP3的表達與骨關節炎的關系，研究人員收集了5例骨關節炎患者和5例外傷對照患者的軟骨組織，發現LRP3蛋白在骨關節炎軟骨中下調。在前交叉韌帶切斷術（ACLT）誘導的大鼠骨關節炎模型中，軟骨的LRP3表達也顯著降低。此外在衰老誘導的小鼠骨關節炎模型中也觀察到類似的結果。這些結果證實了在骨關節炎發展過程中，LRP3在軟骨細胞中的表達下降。
2.LRP3正向調節了軟骨細胞ECM的代謝
之后，研究人員構建了LRP3敲低和過表達的慢病毒載體，以便鑒定LRP3在骨關節炎中的生物學功能。他們發現，LRP3敲低導致正常大鼠軟骨細胞中的合成代謝基因（Col2a1、Acan和Sox9）表達下降，相應蛋白的表達也隨之降低。此外，LRP3敲低還誘導了軟骨細胞細胞外基質（ECM）的分解代謝（圖2）。LRP3的過表達則逆轉了這些影響。這些結果表明，LRP3正向調節了軟骨細胞ECM的代謝。
利用賽業生物構建的LRP3基因敲除小鼠（Lrp3−/−小鼠，產品編號：S-KO-10153），他們進一步確定了LRP3在骨關節炎發病機制中的作用。與野生型對照相比，Lrp3−/−小鼠在第4周和第8周表現出更嚴重的ACLT誘導的軟骨退變（圖2）。Micro-CT 3D重建圖像顯示Lrp3−/−小鼠的異位骨贅顯著增加，關節表面也變得更粗糙。同時，自然衰老的Lrp3−/−小鼠也表現出更嚴重的骨關節炎進展。總的來說，這些結果表明LRP3的缺乏加速了骨關節炎的發展。
LRP3正向調節軟骨細胞ECM的代謝[1]
3.SDC4作為LRP3的下游分子靶點
為了確定這背后的潛在機制，研究人員對LRP3敲低的大鼠軟骨細胞開展了RNA測序分析。他們發現，與軟骨退變密切相關的多配體蛋白聚糖4（syndecan-4, SDC4）在Lrp3敲低后顯著上調。KEGG通路分析顯示，在敲低LRP3后，調控炎癥反應導致OA軟骨退化的Ras/Raf/MEK/ERK信號通路明顯被激活。免疫印跡結果顯示，敲低LRP3可顯著增加Ras和Raf表達，并顯著提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，同時顯著增加SDC4的表達。Ras信號通路抑制劑則消除了LRP3敲低誘導的SDC4上調。根據這些結果，他們認為LRP3通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路負向調節軟骨細胞中SDC4的表達。
為了探究SDC4表達與骨關節炎之間的關系，研究人員在正常大鼠軟骨細胞中過表達SDC4，發現COL2A1和ACAN的表達顯著降低，而基質金屬蛋白酶3（MMP3）的表達增加。MMP3等基質降解酶對軟骨ECM的降解是骨關節炎的重要特征之一。將過表達SDC4的慢病毒載體注射到大鼠膝關節后，大鼠表現出更嚴重的骨關節炎表型。他們還發現，SDC4過表達通過結合和激活ECM降解酶ADAMTS-5來誘導軟骨ECM降解，從而加劇軟骨退變。
研究結論
膽固醇-LRP3-SDC4通路在骨關節炎軟骨退變中的作用[1]
總的來說，研究人員發現高膽固醇抑制了LRP3在軟骨細胞中的表達，引發軟骨ECM代謝的失衡，并導致軟骨退變的發展。其中，SDC4作為LRP3的下游分子靶點，參與調節軟骨細胞ECM的降解（圖3）。LRP3的過表達可以有效延緩骨關節炎的軟骨退變。這項研究強調了膽固醇-LRP3-SDC4通路在骨關節炎發病機制中的作用，為骨關節炎的治療提供了新的潛在靶點。
原文檢索：
[1] Cao, C., Shi, Y., Zhang, X. et al. Cholesterol-induced LRP3 downregulation promotes cartilage degeneration in osteoarthritis by targeting Syndecan-4. Nat Commun 13, 7139 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34830-4
LRP3 KO小鼠
品系名稱：
C57BL/6N-Lrp3em1C/Cya
品系編號：
KOCMP-435965-Lrp3-B6N-VA
產品編號：
S-KO-10153
應用方向：
生殖系統,內/外分泌腺,內穩態/代謝,細胞分化,死亡/衰老,生理系統,代謝研究,發育生物學
打靶方案：
LRP3 flox小鼠
品系名稱：
C57BL/6J-Lrp3em1Cflox/Cya
品系編號：
CKOCMP-435965-Lrp3-B6J-VA
產品編號：
S-CKO-11327
應用方向：
生殖系統,內/外分泌腺,內穩態/代謝,細胞分化,死亡/衰老,生理系統,代謝研究,發育生物學
打靶方案：
