Rason敲除小鼠模型助力發現KRAS突變癌癥的潛在治療靶點
目前已在大約30%的人類癌癥中發現了RAS癌基因的突變。其中，KRAS的突變頻率遠高于HRAS和NRAS。例如，大約12-15%的非小細胞肺癌患者攜帶KRASG12C突變，而攜帶KRAS突變的胰腺導管腺癌（PDAC）患者更是超過90%，尤其是KRASG12D和KRASG12V亞型。
然而，RAS抑制劑的開發一直困難重重，以至于RAS被認為是“不可成藥的靶點”。最近，直接靶向KRASG12C突變的小分子化合物被批準用于治療，但靶向其他KRAS突變在臨床上仍被認為是不切實際的。
近日，中山大學附屬第一醫院、南京大學等研究人員發現，一種由基因間長鏈非編碼RNA（LINC00673）編碼產生的蛋白質RASON是致癌的RAS信號通路的關鍵調控因子，有望成為KRAS突變癌癥的治療靶點。這項成果于10月14日發表在《Cell Research》雜志上。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了多個胰腺癌細胞系，并通過CRISPR技術敲除了多個細胞系中的RASON基因。為了研究胰腺腫瘤生成，他們還使用了多個小鼠模型，并委托賽業生物構建了Rason-/-小鼠。他們通過免疫印跡和LC-MS分析來測定RASON的表達，并通過免疫沉淀、表面等離子共振和核磁共振等實驗來分析RASON與KRAS的相互作用。
研究結果
1.RASON蛋白與PDAC的預后不良相關
人類基因組中存在大量非編碼區，以往人們認為這些非編碼區是不編碼蛋白質的，但近年來的翻譯組研究卻從非編碼區中鑒定出數百種功能性肽段或蛋白質。于是，研究人員著手對胰腺癌樣本的非編碼區開展分析。
在比較三種PDAC細胞系與正常胰腺導管細胞系后，他們發現8個基因間長鏈非編碼RNA（lincRNA）存在差異翻譯，其中LINC00673位列第一。PDAC患者的腫瘤樣本與癌旁正常組織的比較也表明，LINC00673存在差異表達。他們通過免疫印跡分析證實LINC00673編碼了一種108個氨基酸的蛋白質，并命名為RASON。
在一個包含105個PDAC癌癥樣本和配對正常胰腺樣本的獨立隊列中，研究人員發現LINC00673在癌癥樣本中高表達，且其表達與腫瘤分級呈正相關。與此一致，RASON蛋白在癌組織中的表達也顯著升高，并且與腫瘤分級和總生存期較短呈正相關（圖1）。這些結果表明，RASON是一種癌蛋白，可作為PDAC的預后標志物。
圖1 RASON在人類胰腺癌中過表達
2.RASON對KRAS驅動的腫瘤發生至關重要
為了研究RASON在PDAC中的潛在功能，研究人員構建了兩個敲除RASON的胰腺癌細胞系。他們發現，RASON敲除后RAS下游信號通路被抑制，RASON過表達后則增強下游通路。同時，活性KRAS-GTP水平也在RASON KO細胞中下調。此外，他們還生成了Rason同源物基因敲除（Rason-/-）小鼠（該小鼠由賽業生物提供）。Rason-/-小鼠的胚胎成纖維細胞和胰腺組織均表現出RAS信號通路的顯著下調，表明RASON參與了致癌KRAS信號通路的調控。
為了探索RASON是否參與了KRAS驅動的腫瘤發生，他們使用了穩定轉染KRASG12D或KRASG12V的RAS-less MEF細胞系，并測試了Rason KO對KRAS誘導的MEF細胞轉化的影響。他們生成了兩個Rason KO克隆，發現Rason KO幾乎完全降低了KRASG12D或KRASG12V MEF細胞的成瘤潛能。裸鼠皮下成瘤實驗也證實了RASON在突變誘導的MEF細胞轉化中的關鍵作用。與對照細胞相比，Rason KO幾乎完全消除了腫瘤形成。
之后，研究人員將Rason-/-小鼠與KC小鼠（研究PDAC早期階段的成熟模型）雜交，生成了KCR小鼠。與KC小鼠相比，KCR小鼠在6個月和9個月大時的所有癌前病變形成均顯著減少，表明RASON參與了KRAS驅動的胰腺腫瘤形成的早期階段（圖2）。另一種經典的PDAC模型小鼠（KPC小鼠）上的研究也證實了這一點。這些數據表明，RASON是KRAS驅動的小鼠胰腺腫瘤發生所必需的。
圖2 RASON是KRAS驅動的胰腺腫瘤發生所必需的
免疫沉淀分析表明，RASON與KRAS之間存在著直接相互作用。表面等離子共振分析（SPR）則顯示，RASON以非常高的親和力與KRASG12D和KRASG12V結合。核磁共振（NMR）滴定實驗的結果也強烈支持RASON與KRAS直接結合。后續的分析表明，RASON抑制GTP酶激活蛋白（GAP）誘導的GTP水解，使KRAS始終保持在激活狀態（圖3）。
圖3 RASON調控致癌RAS信號通路的示意圖
3.RASON是PDAC的潛在治療靶點
由于KRAS突變的存在，大多數PDAC患者對EGFR抑制劑（西妥昔單抗）產生耐藥性。然而，西妥昔單抗和RASON shRNA的聯合治療最大限度地減少了裸鼠中的腫瘤生長，表明RASON抑制讓KRAS突變的癌細胞對西妥昔單抗敏感。這種聯合治療的效果在PDAC患者來源的類器官上也得到證實，說明RASON是攜帶KRAS突變的PDAC患者的潛在治療靶點。
研究結論
總的來說，研究人員發現了一種對KRAS信號傳導至關重要的RASON蛋白。這種由lincRNA編碼的蛋白質直接與KRAS結合，讓KRAS穩定在與GTP結合的過度激活狀態，因此是KRAS驅動的腫瘤發生和腫瘤維持所必需的。RASON的降低可增加胰腺癌對EGFR抑制劑的敏感性。他們認為，對于人類癌癥中“不可成藥的”KRAS信號通路，KRAS−RASON相互作用也許是一個可以攻擊的靶點。
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KPC 小鼠模型
產品編號：
C001308
背景：
C57BL/6
基因型：
LSL-KrasG12D/+；LSL-Trp53R172H/+ ；Pdx1-Cre
簡介：
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