先天性膽道閉鎖（BA）是一種常見的高致死率新生兒疾病，因膽管狹窄或阻塞而導致膽汁在肝臟內淤積，引起不可逆的肝臟損傷。通過手術可緩解膽汁淤積癥狀，但約有一半嬰兒會繼續出現肝病惡化，最終需要進行肝移植。膽道閉鎖的發病機制仍不清楚，但中性粒細胞被認為在疾病進展中發揮作用。

最近，廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心的研究團隊深入分析了CD177⁺中性粒細胞在膽道閉鎖發病機制中的作用，發現CD177⁺細胞通過形成胞外誘捕網（NET）而在膽管上皮細胞損傷中發揮關鍵作用。

這篇題為“CD177⁺ cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia”的文章于7月發表在肝病學權威雜志《Journal of Hepatology》上。
 

 

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了BALB/c小鼠和NOD/SCID小鼠，并委托賽業生物構建了Cd177基因敲除（Cd177^-/-）小鼠。作者采用單細胞RNA測序和Smart-Seq RNA測序方法獲得了多個細胞的基因表達譜，并通過膽管造影術和組織切片染色等分析小鼠的膽管阻塞和肝臟損傷，同時還開展了一項初步的臨床試驗，以確定N-乙酰半胱氨酸對CD177⁺細胞積累和NET形成的影響。

技術路線
01建立膽道閉鎖小鼠模型并鑒定Gr-1⁺細胞的主要成分
02構建Cd177基因敲除小鼠以明確CD177⁺細胞在膽道閉鎖中的功能
03采用Smart-Seq RNA測序方法分析CD177⁺細胞的基因表達譜
04確定CD177⁺細胞通過形成NET而促進膽管上皮細胞凋亡
05分析NAC在膽道閉鎖治療中的安全性和有效性

研究結果
1.CD177⁺細胞在膽道閉鎖患者中積累
之前的研究顯示中性粒細胞在膽道閉鎖患者的膽管周圍積累，而且在小鼠疾病模型中，Gr-1⁺（中性粒細胞標志物）細胞的去除阻止了疾病的發生，表明中性粒細胞可能具有病理作用。由于Gr-1⁺細胞是一個混合群體，故需要進一步分析來明確各個成分的具體作用。

研究人員采用缺乏適應性免疫系統的NOD/SCID小鼠，通過腹腔注射恒河猴輪狀病毒（RRV）構建出膽道閉鎖小鼠模型。作者發現，與對照組相比，RRV組小鼠肝臟中的Gr-1⁺細胞升高，表明Gr-1⁺細胞可能是對病毒感染做出應答并介導膽管損傷的主要先天免疫細胞群。

作者接著用單細胞RNA測序（scRNA-seq）技術分析了該群Gr-1⁺細胞的組成。基因表達譜顯示細胞表面分子CD177在Gr-1⁺細胞群中高表達，表明CD177⁺細胞是Gr-1⁺細胞的主要功能亞群，同時干擾素刺激相關基因和中性粒細胞脫顆粒相關基因的表達也顯著上調。這些數據表明，在新生小鼠感染RRV后，CD177⁺細胞被激活并表現出強烈的抗病毒反應。作者還發現，膽道閉鎖患者外周血和肝臟活檢樣本中的CD177⁺細胞數量顯著高于對照組。

為了進一步確定CD177⁺細胞在膽道閉鎖中的功能，研究人員委托賽業生物構建了Cd177基因敲除（Cd177^-/-）小鼠，并與野生型小鼠進行了比較。與對照組相比，Cd177^-/-小鼠表現出疾病發作延遲以及發病率和死亡率降低。膽管造影顯示Cd177^-/-小鼠的肝外膽管沒有阻塞。這些結果顯示CD177⁺細胞在小鼠膽道閉鎖的發病機制中起主要作用。

2.CD177⁺細胞通過NET促進BEC凋亡
之后，作者又采用Smart-Seq RNA測序方法分析了CD177⁺細胞的基因表達譜，發現BA患者來源的CD177⁺細胞中與線粒體和中性粒細胞相關的信號通路是兩條主要的上調通路。值得一提的是，參與氧化磷酸化和氧化應激基因表達的上調，表明線粒體功能的激活與CD177⁺細胞的強大免疫功能之間存在密切關聯。

之前的研究發現，CD177⁺細胞的積累與多種自身免疫性疾病有關。不過，當炎癥性腸病發生時，CD177⁺細胞通過釋放IL-22和胞外誘捕網（NET）發揮保護作用。NET是由染色質DNA和多種效應蛋白組成的3D結構，可以捕獲和殺死病原體，也可能導致組織和細胞損傷。

研究人員發現，分離自膽道閉鎖患者的CD177⁺細胞與膽管上皮細胞（BEC）共培養時會誘導后者凋亡；而將不同的NET抑制劑添加到CD177⁺細胞培養物中，收集上清液并作為條件培養基添加到膽管上皮細胞中，則發現NET抑制劑可減少膽管上皮細胞凋亡（圖1）。這些結果表明，在膽道閉鎖發生時，CD177⁺細胞可通過釋放NET誘導膽管上皮細胞凋亡。
 

圖1 膽道閉鎖患者的CD177⁺細胞通過NET促進膽管上皮細胞凋亡
 

總的來說，這項研究解析了先天免疫在膽道閉鎖形成中的作用。CD177⁺細胞通過NET形成和線粒體積累來誘導膽管上皮細胞損傷，而N-乙酰半胱氨酸治療可降低CD177⁺細胞數量和活性氧水平從而抑制NET形成，有助于膽道閉鎖的管理。

原文檢索：

Zhang R, Su L, Fu M, et al. CD177+ cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. J Hepatol. 2022 Jul 5:S0168-8278(22)00409-3. doi: 10.1016/j.jhep.2022.06.015.

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