P2rx7基因是ATP能量代謝通路中的關鍵基因。該基因編碼上皮細胞和免疫效應細胞外的ATP門控陽離子通道，能夠影響機體免疫系統的調控，影響炎癥發生與癌癥發展，是身體免疫調節的關鍵基因之一。P2rx7也參與各種中樞神經系統疾病發病機制的調控，P2rx7基因編輯模型目前已應用于結腸炎相關癌癥與神經系統的研究等等。

賽業生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個小鼠模型的故事，希望對大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是P2rx7基因編輯小鼠。

P2rx7基因簡介
P2rx7基因，又稱P2X7R、P2X（7），位于小鼠的5號染色體上，該基因在ATP能量代謝過程中起著至關重要的作用。它是一種在上皮細胞和免疫效應細胞上表達的細胞外ATP門控陽離子通道^[1]，能夠影響T調節細胞功能^[2]、促炎細胞因子的產生、細胞死亡的調節、感染性病原體的消除等等。并且ATP-P2X7R通路在自身免疫性疾病和炎癥性腸病等慢性炎癥性疾病中扮演著重要角色^[3]。

P2rx7編碼的蛋白能夠實現多種功能，包括ATP結合活性、細胞外ATP門控陽離子通道活性、與脂多糖結合活性、參與細胞體積的負性調節和對疼痛的感覺感知等等。并且參與調控包括有機磷酸酯運輸在內的多個過程的上游或內部、細胞因子產生的正調控和分泌的正向調節。該蛋白位于幾個細胞組成部分，包括質膜外側、神經肌肉接頭和神經元細胞體，是質膜的重要組成部分。其在生物體大腦、心臟和腎臟中有明顯表達。
 

圖1 P2rx7基因相關信息
來源：RDDC罕見病數據中心

（https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=GD4ALG）

P2rx7基因編輯小鼠模型
1.結腸炎相關癌癥
結腸炎相關癌癥（CAC）是炎癥性腸病（IBD）的并發癥。胞外ATP與嘌呤能受體P2RX7的結合是控制腸道炎癥的關鍵因素，起到限制促炎肥大細胞和細胞因子升高并促進調節性T細胞（Treg）和腸神經元存活的作用。研究者研究了P2RX7阻斷在已建立的CAC小鼠模型中的作用。結果發現，雖然P2RX7介導炎癥反應，但它也能在早期起到抑制CAC發展的作用。P2RX7阻斷增強了腸上皮細胞的增殖并保護其免于凋亡。P2RX7阻斷的增殖作用與刺激腸上皮細胞增殖的TGFβ1升高有關。最后，P2RX7阻斷還改變了免疫細胞浸潤，并促進了Treg在消化系統病變內的積累。

圖2 P2rx7基因的敲除方案策略^[4]

（簡稱如下：B,BamHI；RV，EcoRV；K，KpnI；S，SalI）
 

研究者首先通過ES打靶技術將Neo篩選元件插入到P2rx7基因的一個外顯子中，破壞了羧基端編碼區，建立P2rx7基因敲除小鼠。再通過化學藥物誘導的方式構建結腸炎相關癌癥模型^[5]。模型建立成功后，使用硫酸葡聚糖（DSS）進行治療，與對照組相比，P2rx7^-/-小鼠從炎癥病變中恢復得更快，P2RX7的遺傳和藥理學失活都抑制了DSS誘導的結腸炎癥。
 

圖3 結腸組織的HE染色和炎癥評分^[5]
 

后續為了研究P2RX7對炎癥誘導的結腸直腸癌的影響，偶氮甲烷誘導的小鼠接受了三個周期的DSS以模擬慢性結腸炎。治療結束后，P2rx7^-/-小鼠顯示出更高的疾病活動評分，并且與WT小鼠（每只小鼠平均2個息肉）相比，小鼠出現明顯更多的肉眼息肉（每只小鼠平均9個息肉）。正如對CAC模型所預期的那樣，在WT小鼠中腫瘤位于結腸的遠端，而在P2rx7^-/-小鼠中它們侵入到結腸的內側部分。這些結果表明P2RX7功能的改變促進了腫瘤的進展。
 

圖4 P2RX7活性對腫瘤組織發展的影響^[5]
 

以上結果表明，P2RX7失活會抑制炎癥，但同時會增強腫瘤易感性。總之，研究結果揭示了P2RX7在預防CAC中的意外作用，提示在使用P2RX7抑制劑治療IBD時要謹慎，因為可能會增加CAC的風險。

2.神經系統
P2RX7通道參與各種中樞神經系統疾病的發病機制。越來越多的研究表明，它存在于神經元中，但其具體表達部分和功能一直存在爭議。為了解決這一問題，研究者構建了P2RX7 BAC轉基因小鼠，并在體內可視化功能性EGFP標記的P2RX7受體。對小鼠模型的廣泛表征揭示了顯性P2RX7-EGFP蛋白在小膠質細胞、伯格曼膠質細胞和少突膠質細胞中的表達，但在神經元細胞中沒有表達。
 

圖5 P2RX7基因的轉基因載體構建流程圖^[6]

研究人員為了確定P2RX7在大腦中定位的總體模式，對所有小鼠系的腦切片進行了3，3'-二氨基聯苯胺（DAB）染色，如圖6。結果顯示在小腦皮層的分子層中發現了特別高的P2RX7-EGFP密度（圖6A）。此外，在齒狀回（DG）、大腦皮層和嗅球以及丘腦、下丘腦、黑質和腹腦橋的分子層中檢測到強熒光標記。不同大腦區域顯示出相似的蛋白質比例和組織特異性強度（圖6B），表明轉基因的表達反映了內源性P2RX7的表達模式和表達水平，從而暗示控制P2RX7表達的重要調節元件在所選的BAC構建體中得以保留和功能。除了伯格曼膠質細胞（圖6C）外，P2RX7還存在于小腦的小膠質細胞中。
 

圖6 轉基因P2RX7-EGFP的分布格局^[6]

A,腦部抗GFP抗體的DAB染色；B,不同大腦區域中轉基因和內源性P2RX7蛋白的比例;C,小腦與抗GFP和S100β抗體共同標記,可見橈側神經膠質細胞的典型染色模式。

研究者后續使用細胞類型特異性標記物（圖7A–F）和海馬體CA1區域中GFP陽性細胞的定量（圖7G）證明P2RX7-EGFP主要在小膠質細胞中表達（占所有Iba1陽性細胞的93%），而其余GFP陽性細胞中的大多數屬于少突膠質細胞譜系并共表達Olig2（如圖7）。
 

圖7 P2RX7-EGFP在CA1區域中表達細胞類型的同一性和數量^[6]

A-F,轉基因小鼠腦切片與抗GFP抗體、針對指示標記蛋白與S100β（S2532，西格瑪奧德里奇）的抗體。圖中顯示了海馬CA1區域；G,流式細胞分析

綜上所述，在中樞神經系統，P2RX7主要位于小膠質細胞和少突膠質細胞中，并且少量位于大腦中的S100β陽性細胞以及小腦中的伯格曼膠質細胞中。鑒于生理學上的這種分布，以及在神經組織損傷或癲癇持續狀態后沒有觀察到神經元中P2RX7蛋白的上調，可以得出，報告的P2RX7依賴性神經元損傷是小膠質細胞激活的明顯表現的結果，而不是神經元P2RX7受體的直接激活。

總結
P2rx7基因作為ATP能量代謝通路中的關鍵基因，能夠影響機體免疫系統的調控，影響炎癥發生與癌癥發展，并且參與神經系統疾病的發病機制調節。P2rx7基因編輯模型可以用于結腸炎相關癌癥與神經系統等領域的研究，P2RX7失活會抑制炎癥，但同時會增強腫瘤易感性；在中樞神經系統中主要表達于小膠質細胞和少突膠質細胞中，并且少量存在于大腦中的S100β陽性細胞以及小腦中的伯格曼膠質細胞中。P2rx7基因編輯模型為結腸炎相關癌癥的研究以及P2rx7在腦組織中的定位研究和神經疾病的發病機制研究提供了平臺，具有廣泛的科研意義。
 

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P2rx7基因敲除小鼠

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品系名稱：

C57BL/6N-P2rx7^em1Cya

品系編號：

KOCMP-18439-P2rx7-B6N-VA

產品編號：

S-KO-03540

應用方向：

❖ 發育生物學；免疫系統

❖ 皮膚；信號轉導

❖ 骨骼系統；視力系統

打靶方案：

P2rx7基因敲除小鼠打靶方案示意圖

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參考文獻：
[1]Cai X, Yao Y, Teng F, Li Y, Wu L, Yan W, Lin N. The role of P2X7 receptor in infection and metabolism: Based on inflammation and immunity. Int Immunopharmacol.2021 Dec;101(Pt A):108297. doi: 10.1016/j.intimp.2021.108297. Epub 2021 Oct 29. PMID: 34717202.

[2]Figliuolo VR, Savio LEB, Safya H, Nanini H, Bernardazzi C, Abalo A, de Souza HSP, Kanellopoulos J, Bobé P, Coutinho CMLM, Coutinho-Silva R. P2X7 receptor promotes intestinal inflammation in chemically induced colitis and triggers death of mucosal regulatory T cells. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2017 Jun;1863(6):1183-1194. doi: 10.1016/j.bbadis.2017.03.004. Epub 2017 Mar 7. PMID: 28286160.

[3]Neves AR, Castelo-Branco MT, Figliuolo VR, Bernardazzi C, Buongusto F, Yoshimoto A, Nanini HF, Coutinho CM, Carneiro AJ, Coutinho-Silva R, de Souza HS. Overexpression of ATP-activated P2X7 receptors in the intestinal mucosa is implicated in the pathogenesis of Crohn's disease. Inflamm Bowel Dis. 2014 Mar;20(3):444-57. doi: 10.1097/01.MIB.0000441201.10454.06. PMID: 24412990.

[4]Solle M, Labasi J, Perregaux DG, Stam E, Petrushova N, Koller BH, Griffiths RJ, Gabel CA. Altered cytokine production in mice lacking P2X(7) receptors. J Biol Chem. 2001 Jan 5;276(1):125-32. doi: 10.1074/jbc.M006781200. PMID: 11016935.

[5]Hofman P, Cherfils-Vicini J, Bazin M, Ilie M, Juhel T, Hébuterne X, Gilson E, Schmid-Alliana A, Boyer O, Adriouch S, Vouret-Craviari V. Genetic and pharmacological inactivation of the purinergic P2RX7 receptor dampens inflammation but increases tumor incidence in a mouse model of colitis-associated cancer. Cancer Res. 2015 Mar 1;75(5):835-45. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-1778. Epub 2015 Jan 6. PMID: 25564520.

[6]Kaczmarek-Hajek K, Zhang J, Kopp R, Grosche A, Rissiek B, Saul A, Bruzzone S, Engel T, Jooss T, Krautloher A, Schuster S, Magnus T, Stadelmann C, Sirko S, Koch-Nolte F, Eulenburg V, Nicke A. Re-evaluation of neuronal P2X7 expression using novel mouse models and a P2X7-specific nanobody. Elife. 2018 Aug 3;7:e36217. doi: 10.7554/eLife.36217. PMID: 30074479; PMCID: PMC6140716.