造血干細胞（hematopoietic stem cell, HSC）是血液系統的干細胞，能夠向下游分化為所有血液細胞并保持自我更新的能力^[1]。維護造血干細胞正常功能對于維持血液和免疫系統的穩態具有重要的作用。因此，更好地解析造血干細胞的調控機制具有重要的科學意義。

隨著高通量測序以及RNA m6A轉錄組測序（MeRIP-Seq和miCLIP）的開發利用，RNA m6A參與調控的生物進程也逐漸成為研究熱點。在血液系統中，雖然有一些研究發現RNA m6A通過其甲基轉移酶Mettl3和Mettl14調控HSC的功能^[2,3]，但是其分子機制仍不是很清楚。
 

 

2022年2月，清華大學藥學院王建偉團隊在血液專業期刊《Haematologica》發表題為“THDF3 modulates hematopoietic stem cells by recognizing RNA m6A modification on Ccnd1”的研究論文。王建偉實驗室2017級博士生張瀟飛和2019級博士生叢婷婷為該論文的共同第一作者，王建偉研究員，浙江大學第一附屬醫院的姜虹博士和北京解放軍總醫院朱平主任為共同通訊作者。該研究報道了METTL3-RNA m6A-YTHDF3-CCND1信號通路調控造血干細胞重建功能的分子機制。

研究材料
本研究主要使用了Mettl3^fl/fl小鼠、Ythdf1^-/-小鼠、Ythdf3^-/-小鼠（以上三種小鼠均由賽業生物提供）、Mx1-Cre小鼠、Vav-iCre小鼠、Rosa26-LSL-Cas9敲入小鼠、CD45.1小鼠以及CD45.1/2小鼠。

技術方法
研究人員使用了流式分析、流式分選、造血干細胞競爭移植、熒光素酶報告系統、短期歸巢實驗、RNA-seq、免疫共沉淀、蛋白質合成測定、細胞周期實驗、細胞凋亡實驗、蛋白質印跡以及RIP-qPCR實驗技術。

技術路線
01構建Mettl3^fl/fl、Ythdf1^-/-、Ythdf3^-/-小鼠模型

02Mettl3^fl/fl、Ythdf1^-/-、Ythdf3^-/-小鼠血液系統表型分析

03RNA m6A通過甲基轉移酶Mettl3調控HSC的功能機制分析

04RNA m6A通過甲基轉移酶Mettl3調控HSC的模型建立

研究結果
1.敲除Ythdf3導致HSC的重建能力顯著降低，而敲除Ythdf1不影響HSC的重建能力

首先，研究者構建了RNA m6A識別蛋白YTHDF1和YTHDF3敲除小鼠（圖1A-B）（兩種敲除小鼠均由賽業生物提供），分選HSC并進行造血干細胞移植實驗（圖1C）。結果顯示，敲除Ythdf1不影響造血干細胞的重建能力（圖1D），而敲除Ythdf3導致造血干細胞的重建能力顯著降低（圖1E）。因此，本論文進一步探究敲除Ythdf3導致造血干細胞的重建能力降低的分子機制。
 

圖1 敲除Ythdf3導致HSC的重建能力降低

2.敲除Ythdf3導致CCND1蛋白表達降低，但不影響其mRNA的表達
本研究首先對Ythdf3^-/- HSCs進行RNA轉錄組測序，并進行信號通路和基因表達分析（圖2A）。結果顯示，敲除Ythdf3導致核糖體信號通路顯著下調并且核糖體信號通路相關基因表達顯著下調（圖2B-C）。核糖體是蛋白合成的場所，本研究進一步對造血干細胞和造血祖細胞（LSKs）蛋白合成情況進行檢測（圖2D）。結果顯示，敲除Ythdf3導致LSKs蛋白合成顯著下降（圖2E-F）。綜合文獻分析，本研究利用Western Blot實驗對調控造血干細胞功能相關基因進行蛋白表達檢查，結果顯示，敲除Ythdf3導致CCND1蛋白表達下降，但不影響其mRNA的表達水平（圖2G-H）。為進一步驗證該結果，研究者利用shRNA敲降Ythdf3，檢測CCND1的蛋白水平和mRNA水平表達情況。結果顯示，敲降Ythdf3導致CCND1蛋白水平表達下降，但不影響其mRNA的表達水平（圖2I-K）。在敲除Ythdf1的小鼠LSK細胞中，CCND1的蛋白表達無顯著差異（圖2L）。這說明敲除Ythdf3導致CCND1蛋白表達降低不依賴于YTHDF1的表達。
 

圖2 敲除Ythdf3導致CCND1蛋白表達降低

3.YTHDF3通過靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點并且招募翻譯相關蛋白PABPC1和eIF4G2促進其翻譯
為探究YTHDF3調控CCND1蛋白表達的分子機制，本研究利用生物信息學對Ccnd1的mRNA進行分析，發現其5’UTR潛在RNA m6A修飾位點。因此，本研究構建了Ccnd1 mRNA報告基因載體（WT），以及其突變型報告基因載體（MUT）。然后進行實驗檢測，結果顯示，過表達YTHDF3促進報告基因活性顯著升高，并且RNA m6A修飾位點突變后報告基因活性顯著降低（圖3A-C）。此外，本研究利用RIP-qPCR實驗，進一步證實YTHDF3與Ccnd1 mRNA直接結合（圖3D）。以上結果揭示YTHDF3調控CCND1蛋白表達依賴于RNA m6A修飾。同時發現分別敲降PABPC1和eIF4G2均導致CCND1蛋白表達降低（圖3E-F）。Co-IP實驗表明YTHDF3與PABPC1和eIF4G2互作（圖3G-H）。綜合以上結果，本研究揭示YTHDF3通過靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點并且招募翻譯相關蛋白PABPC1和eIF4G2促進其翻譯。那么CCND1是否調控造血干細胞的重建能力？
 

 

圖4 過表達CCND1完全挽救由于缺失Ythdf3導致重建能力降低的表型

5.METTL3通過促進Ccnd1 RNA m6A修飾調控CCND1的翻譯
為進一步探究Ccnd1 mRNA上m6A修飾位點是否由RNA m6A甲基轉移酶METTL3寫入的，本研究進行甲基化RNA免疫共沉淀實驗，結果顯示敲降METTL3顯著降低m6A抗體對Ccnd1 mRNA的富集能力（圖5A-B）。其結果揭示METTL3的表達促進Ccnd1 mRNA m6A修飾的發生。同時，本研究在小鼠LSK中發現，敲除Mettl3導致CCND1蛋白表達降低，但不影響其mRNA水平的表達（圖5C-D）。同時，研究者利用報告基因實驗和Rip-qPCR實驗證實METTL3通過依賴于RNA m6A的方式調控CCND1的表達（圖5E-G）。
 

圖5 METTL3通過促進Ccnd1 RNA m6A修飾調控CCND1的翻譯

6.缺失Mettl3導致HSC重建能力顯著降低，并且過表達CCND1部分挽救由于缺失Mettl3導致HSC重建能力降低的表型
為進一步探究缺失Mettl3對造血干細胞重建能力的影響。本研究分別進行Mettl3敲除（由賽業生物提供）和敲降造血干細胞移植實驗（圖6A和6C-D）。結果顯示，敲除和敲降Mettl3均導致造血干細胞的重建能力顯著降低（圖6B和6E）。但是，敲除Mettl3導致造血干細胞完全不能重建血液系統（圖6B），而敲降Mettl3的造血干細胞重建能力顯著降低，但仍具有一定重建血液系統的能力（圖6E），原因可能是敲降Mettl3后，造血干細胞中還保留一定Mettl3蛋白表達。此結果揭示METTL3是維持造血干細胞干性的必須基因。那么過表達CCND1是否可以挽救由于缺失Mettl3導致造血干細胞重建能力降低的表型？在敲除Mettl3的造血干細胞中，由于造血干細胞干性的丟失，過表達CCND1并不能挽救由于敲除Mettl3導致造血干細胞重建能力降低的表型。在敲降Mettl3的造血干細胞中過表達CCND1，可以部分挽救由于敲降Mettl3導致造血干細胞重建能力降低的表型（圖6F-G）。
 

圖6 缺失Mettl3導致HSC重建能力顯著降低，過表達CCND1部分挽救由于缺失Mettl3導致HSC重建能力降低的表型

研究結論
綜上所述，本研究首次闡明了造血干細胞重建功能的信號通路之一為：METTL3→RNA m6A→YTHDF3→CCND1（圖7），為探索RNA m6A等RNA修飾調控造血干細胞等體細胞干細胞的功能機制提供了重要參考。該研究有助于研究者更加深入了解造血干細胞的調控機制，同時也為改善造血干細胞的功能提供一種新的途徑。
 

圖7 METTL3→RNA m6A→YTHDF3→CCND1信號通路調控HSC重建功能模式圖
 

賽業小鼠模型構建

賽業生物『紅鼠資源庫』可提供同類型Mettl3、Ythdf3、Ythdf1基因敲除小鼠，快至兩周發貨，助力科學研究。
 

Mettl3基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Mettl3^em1(flox)Cya

品系編號：
CKOCMP-56335-Mettl3-B6N-VA

產品編號：
S-CKO-12035

應用方向：
❖ 發育生物學
❖ 信號轉導；蛋白質代謝
❖ 細胞分化；胚胎

Ythdf3基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf3^em1Cya

品系編號：
KOCMP-229096-Ythdf3-B6N-VA

產品編號：
S-KO-06231

應用方向：
❖ 皮膚；信號轉導
❖ RNA剪接；蛋白質代謝
❖ 色素/膚色

Ythdf1基因敲除小鼠

品系名稱：
C57BL/6N-Ythdf1^em1Cya

品系編號：
KOCMP-228994-Ythdf1-B6N-VA

產品編號：
S-KO-06224

應用方向：
❖ 發育生物學
❖ 心血管系統；信號轉導
❖ 蛋白質代謝