致病機理
★經典型苯丙酮尿癥（PKU）
正常情況下，苯丙氨酸是通過肝細胞產生的苯丙氨酸羥化酶（PAH）轉化為酪氨酸，之后再分別合成甲狀腺素，腎上腺素和黑色素等途徑來完成代謝（如圖1）。
 

圖1 正常人體內苯丙氨酸代謝途徑^[1]

而PKU患者由于缺乏苯丙氨酸羥化酶，使得苯丙氨酸不能羥化為酪氨酸，所以遵循另一條代謝通路，即苯丙氨酸（Phe）與α-酮戊二酸進行轉氨基作用，生成苯丙酮酸，引發大量的苯丙酮酸在血液和組織中堆積，最后于尿液中排出。而苯丙酮酸的代謝產物在中樞神經積累并產生毒性，會導致相應的神經系統癥狀（如圖2）。

★四氫生物蝶呤（BH4）缺乏癥
三磷酸鳥苷（GTP）在三種合成酶作用下，合成無活性的四氫生物蝶呤，后者與氧氣結合生成4α-羥化四氫生物蝶呤，然后在翼素-4α-卡賓明脫水酶（PCD）作用后生成（二氫生物蝶呤）BH2，再在二氫生物喋呤還原酶（DHPR）作用下，生成具有生物活性的BH4，發揮重要的生理作用（如圖3）。
 

圖3 四氫生物喋呤生成過程^[1]

生成的BH4會與Phe通過一種GTPCH刺激蛋白（P35）起著調節GTPCH的作用，當血Phe增高時，通過增強GTPCH作用促進新喋呤和生物喋呤的合成（如圖4）^[1]。
 

圖4 四氫生物喋呤作用過程^[1]

小鼠模型
目前應用廣泛的苯丙酮尿癥疾病小鼠模型為Pah^enu1和Pah^enu2兩種，這兩種模型小鼠都是用化學誘變劑乙�；鶃喯趸�脲（ENU）誘變獲得。但Pah^enu2小鼠肝臟所表達的突變蛋白基本上檢測不到催化活性，此外Pah^enu2小鼠在7號外顯子上發生點突變，攜帶這一突變型的患者比Pah^enu1小鼠突變型攜帶者更多。因此對于苯丙酮尿癥的研究使用的多是Pah^enu2模型小鼠。

還有學者利用CRISPR/Cas9系統構建丙酮癥疾病小鼠模型Pah^R408W。根據野生型小鼠Pah基因的12號外顯子序列設計靶點并設計同源重組模板，同源重組模板上帶有胞嘧啶突變成胸腺嘧啶的點突變，從而在DNA修復過程中在小鼠胚胎DNA上引入胞嘧啶到胸腺嘧啶的點突變，最終將PAH蛋白氨基酸序列408位的精氨酸突變成色氨酸（圖5）。
 

圖5 Pah^R408W模型設計示意圖

藍色堿基為靶點sgRNA序列，紅色堿基為突變前的堿基，綠色堿基標注出PAM區域^[2]

通過顯微注射的方式引入CRISPR/Cas9元件，小鼠出生后檢測F0代小鼠基因型，最終獲得陽性小鼠25只，其中Pah^R408W小鼠3只。且Pah^R408W小鼠具有典型的苯丙酮尿癥病癥，正常生理狀況下，體內的苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶作用下代謝生成酪氨酸，隨后一部分酪氨酸在相關酶的作用下生成黑色素。當體內苯丙氨酸羥化酶活性降低，不能正常代謝苯丙氨酸成酪氨酸，因此不能合成足夠多的黑色素，導致出現毛色色素衰退的癥狀。首先對成年（8周齡）野生型和Pah^R408W小鼠進行毛色對比。通過與野生型小鼠對比，發現成年（8周齡）Pah^R408W小鼠毛色出現明顯的色素減退的癥狀（圖6）^[2]。
 

圖6 小鼠毛發顏色圖^[2]

治療方法
目前尚無方法可以根治PKU，最常見的方法是在新生兒篩查中做到"早發現早治療”，減少對患兒生長發育及智力發育等方面損害。因此快速、有效、精準的基因診斷對PKU患兒的盡早治療十分有意義^[3]。當前PKU治療方法主要以飲食療法、糖巨肽法、大中性氨基酸法、補充四氫生物蝶呤法為主，其他潛在療法包括酶替代療法和基因療法仍在探究中。

★飲食療法
如果PKU患者不進食或少進食含苯丙氨酸的食物，則PKU基因未必會對患者造成傷害，所以限制苯丙氨酸攝入不失為一個好方法。由于大部分食物中都含有苯丙氨酸，低苯丙氨酸飲食來源有兩種，一種是天然低蛋白食物，另一種為人工合成的氨基酸藥食。對于純天然的低蛋白食物仍然要嚴格控制攝入量，且要補充其他人體必要氨基酸，維生素等，以免造成營養失衡和骨質疏松、神經損傷加劇等并發癥，而人工合成的氨基酸藥食口味差，進食量又大，會導致患者生活質量下降，對飲食療法的遵循度降低^[4]。

★糖巨肽療法（glycomacropeptides, GMP）
GMP是來自源于干酪乳清的天然蛋白質，其苯丙氨酸含量低，但富含纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸等人體必需氨基酸，也可作為患者低苯丙氨酸食物的來源，目前已用于PKU的治療。GMP飲食療法可與其他療法聯合使用，用于治療PKU患者尤其是需嚴格控制苯丙氨酸攝入的患者。然而該療法具有免疫性不明確且缺乏長期食用的臨床安全性數據等缺點，該方法用于PKU的治療仍需進一步觀測。

★大中性氨基酸法（large neutral amino acids, LNAA）
大中性氨基酸包括支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨基酸）和芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）等，這些大中性氨基酸可與苯丙氨酸競爭性與腦部L型氨基酸運載體結合，抑制苯丙氨酸通過胃腸黏膜和血腦屏障，進而降低苯丙氨酸在胃腸道的吸收和減少其進入腦部的量。故通過飲食增加血液中其他LNAA的濃度，也成為治療PKU的一種方法。但該方法一般推薦成人患者使用。該方法缺乏長期臨床試驗數據，需進一步研究來證明其治療結果的安全性和有效性。

★補充四氫生物蝶呤療法
四氫生物蝶呤作為苯丙氨酸羥化酶的輔助因子，能夠顯著降低BH4缺乏型和對BH4治療產生反應的PAH缺乏型患者體內苯丙氨酸濃度。二鹽酸沙丙蝶呤（sapropterin dihydrochloride）是人工合成的BH4，最初是由日本Daiichi Sankyo公司研制，其片劑由BioMarin Internation公司研制，商品名：KUVAN。該化合物于2007年被美國FDA批準上市，用于治療苯丙酮尿癥及高苯丙氨酸血癥。

★苯丙氨酸氨解酶法（phenylalanine ammonialyase, PAL）
研究發現，通過注入外源性苯丙氨酸氨解酶，可降低患者體內苯丙氨酸濃度，從而達到治療疾病的目的。因為苯丙氨酸氨解酶可將苯丙氨酸降解為E-肉桂酸和少量的氨，E-肉桂酸可迅速轉化為馬尿酸，隨尿液排出體外，所以此代謝途徑可降低患者體內苯丙氨酸濃度。目前，已經啟動PEG-PAL的Ⅲ期臨床研究，用于評價藥物的安全性和有效性^[5]。

★基因療法
近年來隨著生物醫藥技術的發展，基因療法取得了很大的進展。研究發現，98%的PKU患者是由于苯丙氨酸羥化酶基因突變導致患者體內苯丙氨酸羥化酶缺乏或活性不足。苯丙氨酸羥化酶致病突變基因大多位于外顯子區域，且主要集中在外顯子3、外顯子6、外顯子7和外顯子11上。通過基因轉移方法，將含有鼠源PAH-cDNA注入到PKU模型小鼠體內，可恢復小鼠肝臟中苯丙氨酸羥化酶的活性，使苯丙氨酸的代謝恢復正常，從而降低小鼠體內苯丙氨酸的濃度。另一種研究方法是基于PKU患者體內苯丙氨酸羥化酶基因的無義突變。大約10%的PKU患者是由于苯丙氨酸羥化酶基因發生無義突變，產生不穩定或者無活性的截短蛋白。對攜帶PAH基因無義突變的哺乳動物細胞株（COS-7和HEK293）給予氨基糖苷類藥物慶大霉素和遺傳霉素（geneticin，G418），該細胞株在體外可表達全長并且有活性的PAH。結果顯示，無義突變藥物也是一種潛在治療PKU疾病的方法，但仍然需要對其進行體內藥效學研究^[6]。
 

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參考文獻及引用圖片來源：

[1]朱曉涵.苯丙酮尿癥的致病機理與防治措施研究[J].當代化工研究,2018(09):187-189.

[2]馬列. CRISPR-Cas9技術在苯丙酮尿癥小鼠模型構建及基因治療的應用研究[D].華東師范大學,2017.

[3]李錦,李晶,李娜娜,陳寧,孟巖,潘亭亭,張蔓麗,朱軍,田亞平.吉林和遼寧地區80例苯丙酮尿癥患兒苯丙氨酸羥化酶基因突變分析[J].解放軍醫學院學報,2021,42(08):843-848+889.

[4]朱曉涵.苯丙酮尿癥的致病機理與防治措施研究[J].當代化工研究,2018(09):187-189.

[5]馬列. CRISPR-Cas9技術在苯丙酮尿癥小鼠模型構建及基因治療的應用研究[D].華東師范大學,2017.

[6]牛瑞青,馮文化.苯丙酮尿癥及相關治療方法研究進展[J].中國新藥雜志,2018,27(02):154-158.