2022年4月10日，中山大學中山眼科中心劉春巧和劉奕志課題組聯合在美國科學院院刊PNAS上發表研究論文“Tmem138 is localized to the connecting cilium essential for rhodopsin localization and outer segment biogenesis”。該研究首次揭示神經視網膜光感受器纖毛膜蛋白復合體在光感分子視紫紅質(Rhodopsin)和其他外段蛋白運輸及外段形態發生過程中的重要作用，從而為色素視網膜炎（Retinitis Pigmentosa，RP）的病理分子機制提供了必要補充。該項研究同時對纖毛病變引起的中樞神經系統腦水腫的分子機制提供了重要的參考。

                       

⭐ 研究背景

視網膜色素變性（Retinitis Pigmentosa，RP）是導致失明，影響人類生活質量的重要神經類型疾病。其中遺傳性RP世界范圍的發病率約為1：4000，影響我國近三十幾萬人口，目前缺乏有效的治療手段。RP的本質是光感受器壞死，視網膜的光感受器（Photoreceptor）分為兩類，分別是負責暗視野的視桿細胞（Rod）和明視野的視錐細胞（Cone）。Rod數量約占視網膜95%，絕大部分RP由Rod的壞死引起，導致管狀視野（Tunnel vision），并最終失明。

許多RP與負責光感受器外段蛋白運輸的基因突變密切相關。外段蛋白運輸失敗會導致其在內段堆積，使光感受器出現應激性細胞壞死。光感受器在結構上分為外段（Outer segment，OS）、連接纖毛（Connecting cilium，CC）和內段（Inner segment，IS）。OS的膜盤結構是光信號級聯傳導的場所，每天更新約10%，但其本身不具有蛋白和脂類的合成能力。光信號通路蛋白元件需要在IS合成經狹窄的CC纖毛橋運輸至OS以維持其更新速度。盡管已有很多關于纖毛在光感受器外段蛋白運輸中的功能研究，但這些研究大針對纖毛的微管及相關的結構蛋白，動力蛋白（motors）和囊泡運輸復合體（IFT）的研究，而關于纖毛膜蛋白在光感受器外段蛋白的運輸作用的研究尚為空白。

                           

⭐ 研究材料

體內實驗：通過基因打靶技術構建lox小鼠，通過與Sox2-cre小鼠的雜交得到Tmem138全身性敲除小鼠。（本實驗所用Tmem138基因敲除小鼠模型由賽業生物提供）。

體外實驗：體外培養293T細胞進行Tmem138互作實驗。

                       

⭐ 技術方法

01 通過電生理（ERG）及OCT（光學相干斷層掃描）視網膜成像技術對不同時期的 Tmem138基因敲除小鼠視網膜的功能及結構進行活體檢測。

02 通過HE染色，透射電鏡，免疫電鏡，掃描電鏡的方法對Tmem138基因敲除小鼠視網膜進行組織學及超微結構分析。

03 通過免疫熒光共標檢測Tmem138及OS蛋白在視網膜中的定位。

04 通過免疫共沉淀與體內視網膜組織pull down實驗尋找Tmem138蛋白的互作蛋白。

                           

⭐ 技術路線

                                                 

⭐ 研究結果

1. Tmem138基因敲除小鼠模型的構建及表型分析

劉春巧課題組一直關注神經視網膜的發育和遺傳疾病的研究。前期對調控纖毛發育和細胞極性運輸的Wnt/PCP信號通路進行了研究（Guo et al., 2018; IOVS and EXP EYE RES; Guo et al., 2020, IOVS and Development）并發現了幾個受Prickle1調節的跨膜蛋白。其中TMEM138突變會引起Joubert綜合癥并伴隨視網膜營養不良。為了研究TMEM138突變引發視網膜疾病的分子機理，作者首先構建了具有Joubert綜合癥表型的Tmem138基因敲除小鼠模型（Tmem138基因敲除小鼠模型由賽業生物有限公司提供），該品系小鼠具有腦室擴張，精子發生障礙及視網膜退行性變性等與Joubert病人相似的表型（圖1）。

圖1：Tmem138缺失導致腦室擴張，精子缺失癥以及視網膜退行性疾病

                             

2. Tmem138膜蛋白在光感受器細胞的定位分析

接下來，作者通過多重免疫熒光的分子標記，區分纖毛外段的不同區域，并通過基因敲除小鼠驗證，確立了Tmem138定位于連接纖毛的近端（圖2）。

圖2：Tmem138定位于連接纖毛

                            

3. Tmem138基因敲除導致纖毛胞質蛋白Ahi1在CC遠端缺失

因為Tmem138定位于連接纖毛，作者探究了光感受器纖毛組分是否發生改變，作者分別檢測了纖毛基體（Cep164），連接纖毛（Ahi1），軸絲（Rp1）以及IFT蛋白運輸組分（Ift88，Kif3A）變化，發現Tmem138缺失后能導致OS發育早期（P5）連接纖毛蛋白Ahi1的顯著改變（圖3）。

圖3：Tmem138缺失導致連接纖毛Ahi結構改變

                          

4. Tmem138缺失未導致纖毛結構性改變

接著，作者繼續探究了Ahi1纖毛蛋白的改變是否是由于其纖毛結構破壞所致，掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）的結果顯示Tmem138缺失后光感受器纖毛結構未發生明顯變化（圖4）。

圖4：SEM和TEM顯示光感受器纖毛結構

                       

5. Tmem138基因敲除小鼠表現出早發且快速的視網膜退化

為了進一步了解Tmem138在OS生物發生中的作用，作者檢測了光感受器從P3到P14發育過程中視紫紅質的表達和定位，發現Tmem138敲除后視紫紅質最早從第5天開始在內段堆積（圖5）。

圖5：Tmem138缺失導致光感受器外段發育異常

                               

6. Tmem138/Tmem231/Ahi1纖毛復合體介導Rhodopsin跨纖毛運輸

作者繼續探究了Tmem138介導光感受器外段發生的機制，通過免疫共沉淀和視網膜pull down實驗，作者發現Tmem138可以與兩個JBTS蛋白（Ahi1和Tmem231）以及視紫紅質相互作用。因此作者做了一個假設的模型：即位于連接纖毛膜基部的Tmem138形成Tmem138/Tmem231/Ahi1復合體對CC部位分子組裝至關重要，這種Tmem138復合體與視紫紅質相互作用，以促進其在不同馬達蛋白驅動下沿者微管或微絲結構進行運輸。Tmem138的缺失可導致Ahi1和Tmem231定位錯誤，最終阻礙了視紫紅質以及其他OS蛋白通過CC（圖6）。 

                           

⭐ 總結

該研究首次揭示神經視網膜光感受器纖毛膜蛋白復合體在視紫紅質和其他外段蛋白運輸中起到的重要作用，從而為RP的病理分子機制提供了必要補充。該項研究同時對纖毛病變引起的中樞神經系統腦水腫的分子機制提供了重要的參考。

                      

⭐ 補充說明

該項目研究得到了國家自然科學基金，廣州市科技創新項目及中山大學百人計劃的支持。中山大學中山眼科中心、眼科學國家重點實驗室為第一單位。郭佃磊博士后和汝佳麗博士是本論文的第一作者，劉春巧研究員和劉奕志教授是本論文通訊作者。

                               

⭐ 參考文獻：

GUO D, RU J, XIE L, et al. Tmem138 is localized to the connecting cilium essential for rhodopsin localization and outer segment biogenesis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2022, 119(15): e2109934119.