根據中國人口協會、國家衛健委發布的數據顯示，中國育齡夫婦的不孕不育率從20年前的2.5%~3%攀升到近年的12%-15%左右，不孕不育者約有5000萬人。據相關機構預測，到2023年，中國育齡人群整體不孕不育率將會達到18.2%，育齡人群的生育狀況不容樂觀，本文總結了影響不孕不育的相關因素和相關動物模型，以期促進不孕不育的機制研究和藥物研發。

圖1 不孕不育的發生率^[1]

01生殖系統簡介
1.1   男性生殖系統
男性生殖系統包括外部生殖結構和內部生殖結構，外部部分包括陰莖、陰囊和睪丸。其中睪丸通常位于陰囊中，由眾多的生精小管構成，是精子發生的部位。生精小管間具有間質細胞，能分泌雄性激素促進生殖器官發育、成熟和第二性征的形成及維持。生精小管經輸出小管到達附睪。

附睪是大而卷曲的管，精子在這里經過重要發育階段而成熟。附睪下端經輸精管而達于尿道。精液經尿道、陰莖而通體外。男性的內部生殖器官包括輸精管、射精管、尿道、精囊、前列腺和尿道球腺。精囊腺、前列腺和尿道球腺是重要的附屬腺體，它們的分泌物構成精液的主體，所含的營養物質，能促進精子的活性。
 

圖2 男性生殖系統^[2]

精子發生是男性執行生育功能的關鍵事件之一，成熟精原干細胞在睪丸微環境中通過一系列發育過程分化為成熟精子。睪丸組織中的體細胞微環境主要由支持細胞（Sertoli cell）、間質細胞（leydig cell）、管周肌樣細胞（myoid cells）和睪丸巨噬細胞（macropahge）共同形成^[3]。

支持細胞是生精小管的上皮支持細胞，呈高大的柱狀，從基底膜延伸到管腔，它們圍繞著增殖和分化的生殖細胞。主要功能是為精子提供毛細血管來源的營養，形成血-睪丸屏障，產生有助于精細胞成熟的睪丸液。間質細胞位于生精小管之間，細胞質中含有許多膽固醇脂滴。間質細胞制造和分泌睪酮，進而促進精子的產生、附屬性腺的分泌和男性次要特征的獲得。管周肌樣細胞是鱗狀可收縮的細胞，可促進精子的運輸。睪丸巨噬細胞能夠促進精原細胞的維持，并阻礙其它免疫系統物質進入睪丸組織。
 

圖3 生精小管和小管外間質組織中的細胞^[4]

 1.2   女性生殖系統
女性生殖系統也包括外部生殖結構和內部生殖結構，外部生殖結構包括陰阜、大陰唇、小陰唇、陰蒂、陰道前庭，內部生殖結構包括陰道、子宮、輸卵管及卵巢。卵巢是卵子發生的部位，存在數量眾多的處于不同發育階段的濾泡。每個濾泡內含有一個卵細胞，濾泡液含有雌性激素，能促進生殖管道、乳房的發育以及第二性征的成熟。卵子成熟后，濾泡破裂，卵及濾泡液一起排出。所殘余的濾泡即逐漸縮小，并由一種黃色細胞所充滿，成為黃體。成熟卵排出后，進入輸卵管前端的開口（輸卵管傘），沿輸卵管下行達于子宮，受精作用發生于輸卵管上段。已受精的卵將植于子宮內壁上，在這里接受母體營養而發育。
 

圖4 女性生殖系統^[5]

卵巢是雌性執行生殖功能的主要器官，卵巢中有五種主要的細胞類型：顆粒細胞（GC），卵泡膜細胞（TC）和基質細胞，平滑肌細胞，內皮細胞和免疫細胞^[6]。

卵巢顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長啟動、發育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動。卵泡發育的顯著標志之一就是顆粒細胞迅速生長及增殖，而成年動物的卵泡閉鎖主要是由顆粒細胞凋亡引起，尤其在卵泡發育后期，此外，顆粒細胞還與卵泡膜細胞共同完成卵巢激素的合成，維持著有利于卵母細胞生長和成熟的微環境。

卵泡外膜則由一層或多層平滑肌細胞構成，接受自主神經支配，促使其收縮，其精確作用尚不清楚，但平滑肌細胞的收縮與排卵及卵泡閉鎖有關。卵巢的血管重塑支持著濾泡生長和變性，內皮細胞參與血管重塑過程。卵巢含有多種免疫細胞，如巨噬細胞、淋巴細胞、肥大細胞、粒細胞等，可分泌可溶性調節因子，單獨或聯合調節卵泡發生、排卵和黃體形成。
 

圖5 卵泡成熟過程

南模生物在小鼠生殖系統特定細胞類群marker基因中敲入Cre/Dre 等重組酶元件，可以在特定細胞群里進行基因及細胞功能的研究。具體模型信息見下表：

02影響不孕不育的遺傳因素
男性的不育最常由精子發生障礙引起，臨床上稱為少精子癥或無精子癥。男性不育致病因素復雜（見圖6），目前已知的主要因素包括遺傳因素、抗精子抗體、感染、內分泌因素、疾病、鋅缺乏、環境、飲食和吸煙等。在少精子癥、弱精子癥及非梗阻性無精子癥發生的因素中，遺傳因素占到了大約30%，其中包括基因突變和染色體異常^[7]。
 

圖6 男性不育相關因素致病過程模式圖^[7]

X、Y染色體作為決定性別發育的重要染色體，其結構、數量變化及其基因仍是學術界研究男性不育的重點。例如，Y染色體上存在的精子發生相關基因——無精子因子（AZF）區，是最常見的染色體微缺失區域。相關基因則有無精子缺失基因（DAZ）、RNA結合基序基因（RBMY）、USP9Y基因。X染色上的關鍵基因則有雄激素受體（AR）、Anos1、Rhox及USP26等。此外，位于常染色體上的CFTR基因純合子突變會引起男性先天性雙側輸精管缺失，導致阻塞性無精子癥。其它關鍵基因還有INSL3-RNFP2、SYCP3、KLHL10、AURKC等。線粒體DNA的缺失也對男性生育有一定的影響^[7]。

對于女性而言，引起不孕癥的因素以生殖系統相關病變居多，主要為子宮病變和卵巢病變，此外機體免疫功能異常（即產生致病性抗體如抗精子抗體、抗卵巢抗體等）及社會-心理-精神因素對不孕癥也有明顯影響^[8]。近來發現，單基因變異與女性不育也有一定的關系。
 

圖7 2015年我國女性不孕的主要原因構成^[9]

46,XY性腺發育不全又稱之為Swyer綜合征，主要與參與性別決定過程中的基因突變有關，例如NR5A1，MAP3K1，GATA4，FOG2基因突變。NR5A1編碼的轉錄因子，可調控性腺發育和生殖相關的基因表達，該基因突變后將導致性腺發育不全。SRY基因一直被認為是性腺發育途徑中的關鍵基因，約有15%的46,XY 患者攜帶SRY基因突變。最近發現DHX37基因也與性腺發育不全有關。

此外，BMP15在卵巢早衰病中起到決定性的作用，缺失突變后在純合狀態下引起卵巢功能不全。NOBOX、FLGLA、EIF4ENIF也與卵巢早衰病有關。LHCGR、ZP基因則與空卵泡綜合征有關^[10]。

03 不孕不育小鼠模型
目前不孕不育的臨床治療主要依靠輔助生殖技術，但其存在費用高、操作繁瑣以及高多胎率等一系列亟待解決的問題。因此，研究不孕不育的發病機制并針對病因給予治療是今后的主要研究方向。通過構建不孕不育小鼠模型，將有助于疾病機制的研究和臨床治療。

 3.1   雄性不育小鼠模型^[11]
雄性不育小鼠模型可以通過物理方法（例如，熱刺激、輻射效應）、化學方法（例如，化療藥物誘導）、手術方法（實驗性隱睪、手術致精索靜脈曲張）以及基因敲除的方法構建。這里主要介紹下基因敲除小鼠模型。Xrcc1是一種重要的DNA修復基因，在精子發生早期高度表達。Xrcc1基因敲除小鼠與野生型小鼠比較，睪丸體積更小、精子活性減弱、生精小管數量減少，且誘導睪丸活性氧水平升高，損害精子和精原干細胞。雄激素和雄激素受體（AR）促使睪丸發揮正常生理功能。AR敲除小鼠生殖細胞發育不完整，導致無精子癥及不育。MIWI蛋白是RNA誘導沉默復合體（RISC）的核心元件-Argonaute蛋白家族成員之一，敲除Miwi后，會造成小鼠精子產生明顯缺陷，表現為雄性不育。

3.2   雌性不育小鼠模型
雌性不育的疾病類型較多，本文著重總結了人群中多發的多囊卵巢綜合征和卵巢早衰相關小鼠模型。

• 多囊卵巢綜合征小鼠模型^[12]

多囊卵巢綜合征（PCOS）是女性不孕不育的主要原因之一。在過去幾十年里，PCOS的動物模型主要由人工誘導而成，例如雄激素誘導和高脂飲食。有研究者認為，不同基因背景的小鼠對脫氫表雄酮（DHEA）（雄激素的一種）誘導的反應存在一定的差異。DHEA在C57BL/6J背景下誘導的PCOS小鼠模型比BALB/c在代謝方面更接近于PCOS患者。

現在有研究者認為PCOS表現為多基因相關性，通過構建多基因型小鼠可模擬PCOS癥狀。瘦素缺乏和瘦素受體缺乏小鼠表現出一系列的類PCOS的生殖和代謝特征，但沒有呈現卵巢多囊化。而下丘腦瘦素受體和胰島素受體特異性敲除小鼠，則表現出明顯的代謝紊亂和卵巢形態改變，與正常小鼠相比有較多的退化卵泡。雌激素受體α和芳香化酶CYP19敲除小鼠，卵巢出現囊性出血，不排卵。

此外，過表達人纖維溶酶原啟動物抑制劑-1小鼠，出現了不排卵、黃體缺失的現象，且有50%以上的雌鼠出現了卵巢多囊化。卵巢過表達神經生長因子（NGF）的小鼠可以導致卵泡在竇性卵泡期出現閉鎖、凋亡增加、小的生長卵泡積累，LH水平有輕度的持續性升高，這使卵巢多囊化的幾率增加�？偨Y如表1。

表1：不同基因修飾PCOS小鼠模型的特征^[12]

• 卵巢早衰動物模型^[13]

近年來，卵巢早衰（POF）（又稱為早發性卵巢功能不全（POI））的發生率每年上升，且不斷向低齡化趨勢發展，成為中國女性不孕的常見病因之一。根據POF不同的發病機制,目前已經成功構建的模型有：基因敲除模型、自身免疫模型、放療模型、化療藥物模型、卵巢切除模型、D-半乳糖模型以及環境損傷模型等。這里主要介紹基因敲除模型。

隨著分子生物學的發展，學者們發現了與POF發生相關的基因，包括脆性X智力低下基因 1（FMR1）、骨形成發生蛋白15基因（BMP 15）、生長分化因子9基因（GDF9）、叉頭框L2基因（FOXL2）等。FOXL2是調控基因表達的關鍵轉錄因子，在顆粒細胞的發育過程中發揮重要作用，敲除雌性小鼠FOXL2基因后，發現小鼠顆粒細胞停止生長，隨后卵母細胞死亡，大量卵泡閉鎖，生育能力降低。BMP15 通過促進卵母細胞發育、防止顆粒細胞凋亡，參與促進卵泡生長和成熟；BMP15基因敲除雌性小鼠生育能力明顯下降。

表2：各種常見POF動物模型建模方法比較^[13]

南模生物優吉鼠模型資源庫含多種自主構建的不孕不育研究大小鼠模型，可用于不孕不育癥的基礎研究和藥物開發，詳細模型信息見下表：

*臨床相關性代表目的基因的同源人類基因在臨床上報道過與該生殖系統疾病有相關性。
#品系表型預測代表有文獻報道過具有類似基因型的小鼠出現過該生殖系統疾病的表型。

南模生物深耕基因編輯領域，提供全方位模式生物服務，包括基因修飾成品模型供應、個性化模型定制、飼養繁育、表型分析、藥效評價等，滿足不同實驗室需求。

參考文獻:

[1] Agarwal A, Majzoub A, Parekh N, Henkel R. A Schematic Overview of the Current Status of Male Infertility Practice. World J Mens Health. 2020 Jul;38(3):308-322. doi: 10.5534/wjmh.190068.

[2]https://my.clevelandclinic.org/health/articles/9117-male-reproductive-system

[3] Wang M, Liu X, Chang G, et al. Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis. Cell Stem Cell. 2018 Oct 4;23(4):599-614.e4. doi: 10.1016/j.stem.2018.08.007.

[4]https://www.histology.leeds.ac.uk/male/sertoli_cells.php

[5]https://elsevier.health/en-US/medstudents/flashcard-female-reproductive-system

[6]Fan X, Bialecka M, Moustakas I, Lam E, Torrens-Juaneda V, Borggreven NV, Trouw L, Louwe LA, Pilgram GSK, Mei H, van der Westerlaken L, Chuva de Sousa Lopes SM. Single-cell reconstruction of follicular remodeling in the human adult ovary. Nat Commun. 2019 Jul 18;10(1):3164. doi: 10.1038/s41467-019-11036-9.

[7] 馬珂,田稼,馬良宏.遺傳因素與男性不育相關性研究進展[J].中國男科學雜志,2019,33(05):69-73+78

[8] 李俊瑩,姜麗麗,馮子懿,劉巋然.影響女性不孕因素的研究進展[J].醫學綜述,2018,24(24):4858-4863.

[9] 《2016-2022年中國生殖醫學設備行業運營現狀及十三五投資決策分析報告》，中國報告網