近日，FDA批準了傳奇生物和強生合作研發的CAR-T細胞治療產品Carvykti，用于治療復發性/難治性多發性骨髓瘤。作為全球第二款治療多發性骨髓瘤的CAR-T產品，Carvykti對標由BMS和藍鳥生物合作研發的Abecma。臨床數據顯示，Carvykti的客觀緩解率（ORR）為97.9%，完全緩解率（sCR）為78.4%^[1]；Abecma的ORR為72%，sCR為28%^[2]。從數據上看，Carvykti的療效優勢明顯。Carvykti從首次獲得臨床試驗批準到最終上市耗時接近4年的時間，而且臨床前研究也耗費了大量的時間和精力。其間，臨床前藥物的有效性和安全性評價對于IND申報至關重要，本文將圍繞CAR-T細胞治療臨床前的研究，為大家介紹幾種藥理學模型的選擇。

體外模型
1●腫瘤靶點過表達穩轉株
CAR-T細胞的作用機制是通過CAR分子的scFv特異性識別腫瘤靶點抗原，然后進行殺傷。因此，人為構建出表達腫瘤抗原的細胞，可以用來檢測CAR-T的殺傷能力。例如，使用慢病毒載體將CD19基因遞送至293T細胞，構建CD19-293T過表達穩轉株，使293T細胞表面過表達CD19抗原，進一步驗證抗原表達陽性率，并用于后期驗證實驗。

圖1. CD19-293T細胞CD19抗原陽性率檢測。圖源：賽業生物。

除了人為構建的腫瘤細胞模型，自然表達抗原的腫瘤細胞系也被用來檢測CAR-T細胞的殺傷能力。殺傷效果的檢測實驗一般會用到流式細胞術、熒光素酶酶法、鉻釋放試驗等。因此相應的，也可以構建：

熒光素酶穩轉株
例如，諾華公司在2018年發表的靶向BCMA的CAR-T研究中，就使用了熒光素酶法^[3]。熒光素酶可以催化熒光素氧化，在熒光素氧化的過程中，會發出生物熒光。研究者們在人多發性骨髓瘤細胞KMS-11中引入螢火蟲熒光素酶（Luc）基因，構建出KMS-11-luc細胞，然后將CAR-T細胞和KMS-11-luc細胞按不同的效靶比（E:T ratio）共孵育20小時，檢測細胞混合液的熒光強度，可以代表剩余的靶細胞數量。

圖2. 使用熒光素酶法繪制的腫瘤細胞裂解曲線^[3]。

⁵¹Cr放射性標記的腫瘤細胞
2015年，在賓大和諾華的一項共同研究中，使用了鉻釋放法來檢測CAR-T細胞的殺傷能力^[4]。首先使用同位素⁵¹Cr標記U87 膠質瘤細胞，然后將CAR-T細胞與腫瘤細胞按不同的效靶比共孵育，腫瘤細胞被裂解后，⁵¹Cr從細胞中釋放至上清液，檢測上清液⁵¹Cr的含量，可以代表裂解的腫瘤細胞的數量。
 

圖3. 使用鉻釋放法繪制的腫瘤細胞裂解曲線^[4]。

2●Jurkat報告細胞系統
除了腫瘤細胞模型外，也可以用Jurkat報告細胞代替從PBMC分離并活化出的T細胞，來進行早期的評估試驗。Jurkat細胞是人類T淋巴細胞的永生細胞系，最初在1970年代后期，從一名患有T細胞白血病的14歲男孩的外周血中建立的。在CAR-T的體外試驗中，Jurkat細胞常被用于T細胞信號傳導的研究。

紀念斯隆-凱特琳癌癥中心在2019年的文章中，為了研究CAR-T細胞是否具有抗原依賴性，將紅色熒光蛋白（RFP）基因遞送至Jurkat細胞CD3ζ信號傳導的下游區，同時在CAR分子上表達綠色熒光蛋白（GFP），構建出CAR/GFP修飾的Jurkat-RFP報告細胞^[5]。綠色熒光代表CAR分子轉導成功，而紅色熒光代表CAR信號被成功傳導。研究者們將CAR/GFP修飾的Jurkat-RFP報告細胞與表達抗原的靶細胞、不表達抗原的對照細胞分別共孵育，在不表達抗原的對照組中，如果同時有綠色熒光和紅色熒光，則說明該類別的CAR-T細胞不具備抗原依賴性，即不是理想的CAR-T細胞。
 

圖4. 使用流式細胞術檢測CAR/GFP修飾的Jurkat-RFP報告細胞的熒光表達（縱坐標：綠色熒光；橫坐標：紅色熒光）^[5]。

體內模型
1●動物腫瘤模型
在CAR-T治療的臨床前研究中，動物腫瘤模型的藥效評價尤為重要。由于小鼠基因組與人類基因組的相似程度高，并且小鼠模型的構建成本低，因此小鼠成為了研究人類疾病的最佳實驗模型。而免疫缺陷小鼠對外來移植物的排斥弱，非常適合動物腫瘤模型的構建。目前國際上公認的免疫缺陷程度最高的小鼠是具有Prkdc和Il2rg基因缺陷的小鼠，這兩種基因的突變使小鼠的T細胞、B細胞和NK細胞的活性完全喪失。例如由賽業自主研發的C-NKG重度免疫缺陷小鼠（NOD/Shi-Prkdc^scid Il2rg^em1/Cgen），在NOD/Shi-scid背景品系上敲除Il2rg基因，擁有補體活性降低、巨噬細胞對人源細胞吞噬作用弱、樹突狀細胞功能下降、無T細胞和B細胞泄漏等特性，適合用于CDX和PDX模型的構建、免疫系統人源化小鼠模型的制備、GvHD模型構建和腫瘤免疫相關的研究。

除了重度免疫缺陷小鼠，裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠也可以用于腫瘤模型的構建。裸鼠（Nude小鼠）是上世紀60年代在英國發現的第一個免疫功能障礙小鼠；重度聯合免疫缺陷小鼠（Server Combined Immune-Deficiency, SCID）具有Prkdc突變，表現為T細胞和B細胞缺失；NOD/SCID小鼠由非肥胖糖尿病（NOD）小鼠和SCID小鼠雜交產生，免疫缺陷程度進一步提高。隨著生物科技的不斷發展與進步，免疫缺陷動物也在被不斷地優化和迭代。選擇合適的免疫缺陷動物，可以在實驗中取得更加優秀的成果，助力相關領域的研發。

腫瘤細胞系異種移植模型（Cell Line-Derived Xenograft, CDX）是將腫瘤細胞系移植到同種或異種動物體內形成腫瘤。腫瘤細胞系移植腫瘤保持著原發腫瘤的大部分生物學特性，成瘤效率高，實驗周期短，因此很適合用于腫瘤藥物的早期藥效評價。在CAR-T治療的研究中，使用含有熒光素酶基因的腫瘤細胞構建CDX模型，可以通過熒光監測腫瘤細胞的生長以及CAR-T細胞的抗腫瘤活性。

人源腫瘤組織異種移植模型（Patient-Derived Xenograft, PDX）是直接用患者新鮮腫瘤組織接種于免疫缺陷小鼠建立的模型。腫瘤組織在小鼠體內環境生長并傳代2-3次，可以更好地表現親代腫瘤性狀，并且維持了腫瘤的異質性。與CDX模型相比，PDX模型最大的優勢是保留了親本腫瘤的異質性和組織學特性，例如細胞形態、血管系統、基質形態等，模擬了腫瘤發生的體內環境。
 

圖5. PDX模型的構建流程^[6]。

同源移植模型（Syngeneic model）是將同種背景來源的腫瘤細胞系接種至免疫健全的近交系小鼠。受體小鼠擁有完整的鼠源免疫系統，具有完全的免疫活性，且該免疫系統與同種移植腫瘤組織相容，能最大化模擬腫瘤微環境的真實生活情況，缺點是移植的小鼠組織可能無法完全代表臨床情況下人類腫瘤的復雜性。

人免疫系統重建動物模型（Human immune system-engrafted models, HIS）是通過異種移植人類免疫細胞或組織和/或其祖細胞到免疫缺陷小鼠中產生的。這類小鼠可以更有效地模擬人體免疫應答，為腫瘤免疫、自身免疫性疾病，以及人特異性傳染疾病（例如由人類免疫缺陷病毒HIV引起的獲得性免疫缺陷綜合征AIDS）的轉化研究提供了優秀模型。

2●熒光素酶穩轉株與動物腫瘤模型聯合應用
與體外模型構建表達熒光素酶的腫瘤細胞的原理一致，體內模型中，也是利用熒光素氧化發光的特性，通過活體成像儀，監測體內腫瘤的大小、分布，并通過平均熒光強度（FMI）量化腫瘤的生長。例如構建急性淋巴細胞白血病的CDX模型時，可以將熒光素酶基因遞送至人急性淋巴細胞白血病細胞Nalm6，構建Luci-Nalm6細胞。將不同劑量的Luci-Nalm6接種至C-NKG和NOG小鼠中，第21天的活體成像如下圖所示。
 

圖6. 活體成像檢測Luci-Nalm6細胞異種小鼠腫瘤模型腫瘤生長情況（上：第21天活體成像檢測；下：平均熒光強度）。來源：賽業生物。