文章標題：Yiqi Jiedu Huayu Decoction Alleviates Renal Injury in Rats With Diabetic Nephropathy by Promoting Autophagy
發表期刊：Frontiers in Pharmacology
發表時間：2021年4月
影響因子：5.81
合作客戶：重慶醫科大學
百趣生物提供服務：中藥非靶標代謝組學

01 研究背景
糖尿病是一種慢性代謝疾病，是世界上最重要的健康問題之一。患者數量多，據統計全球糖尿病患者數量將在2035年達到5.92億。糖尿病腎病(DN)是糖尿病引起的常見微血管并發癥，是終末期腎功能衰竭(ESRD)的主要原因。糖尿病腎病組織損傷包括系膜擴張、基底膜增厚和腎纖維化。腎纖維化的發展是糖尿病腎病患者腎功能持續下降并最終發展為終末期腎病的重要原因。足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，足細胞損傷時引發糖尿病腎病持續性蛋白尿和腎纖維化的重要原因。足細胞作為終末分化細胞，受損難再生。因此，足細胞具有很高基礎自噬水平在面對各種刺激時保持自身的動態平衡。在糖尿病腎病患者體內足細胞的自噬活性受到抑制，自噬主要受mTOR通路調控，抑制mTOR通路可以促進自噬，改善足細胞損傷和腎功能。因此，靶向mTOR通路可能是治療DN的一種合適的治療方法，促進自噬活性，改善足細胞損傷和腎臟病理損傷，恢復腎功能。

糖尿病腎病的治療措施主要包括控制血糖、血脂、血壓和應用血管活性藥物。厄貝沙坦作為血管緊張素II受體阻滯劑是臨床治療糖尿病腎病的代表性藥物，能有效降低患者的蛋白尿。在一定程度上延緩了DN的發展，但不針對腎臟損傷，難以完全預防腎功能衰竭。因此，有必要開發安全有效的治療方法。益氣解毒化瘀湯(YJHD)是一種經改良的中藥方劑，已用于臨床治療糖尿病腎病(DN)。YJHD由七種草藥組成，其中黃芪、葛根、黃連和桑葉已被證明對糖尿病及糖尿病并發癥有治療作用。重慶醫科大學曹文富課題組軒晨在相關研究工作中，使用YJHD，旨在調節PI3K/Akt、AMPK和mTOR通路的活性，促進自噬，減輕足細胞損傷和腎臟病變，改善腎功能。

02 研究設計
將Sprague-Dawley小鼠隨機分為空白對照、陰性對照、糖尿病模型、厄貝沙坦處理(陽性藥物組)和低、中、高（YJHD-L、M、H）3個劑量處理組。用鏈脲佐菌素復制動物模型，然后YJHD治療，連續12周。實驗期間采集血液和尿液樣本，并對代謝和腎功能進行了評估。通過腎臟形態、蘇木.精-伊紅染色、馬森染色、高.碘.酸席夫染色、高.碘.酸席夫甲.胺染色和透射電鏡觀察，評價腎臟病理損傷程度。采用免疫組織化學、蛋白印跡分析和實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)分別檢測蛋白和基因的表達水平。

03 研究結果
1.YJHD成分鑒定（百趣中藥非靶）
客戶送中藥口服試劑到我司檢測，采用UHPLC-MS/MS對YJHD樣品進行了測定分析，揭示了所有化合物的化學組成。共鑒定出15個活性成分(圖1C)：1)萼花苷-7-葡萄糖苷，2)山.奈酚，3)黃芩素，4)木犀草素，5)萼花素，6)黃芪甲苷IV，7)槲皮素，8)異鼠李素，9)橙皮素，10)蘆丁，11)巴馬汀氯，12)芒柄花素，13)隱丹參酮，14)小檗堿，15)葛根素。
 

圖1. YJHD化學成分鑒定

2.糖尿病癥狀改善和腎功能保護
測定陰性對照組和空白對照組小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平，以評價YJHD的安全性。證實YJHD無肝毒性作用(圖2J)。藥物干預處理后，發現對照組體重增加，而糖尿病組生長停滯。與糖尿病組比較，YJHD-H組小鼠體重明顯增加。與空白對照組相比，其他處理組小鼠24小時攝食量和飲水量均顯著增加。YJHD-H組的對于糖尿病癥狀的改善最為明顯（評估指標:24h尿量、24h尿蛋白定量、血清Cr等），證實YJHD能改善糖尿病小鼠的癥狀和腎功能，其中以高劑量組的效用最為明顯。
 

圖2. YJHD改善糖尿病癥狀和腎功能

3.YJHD減輕腎組織病理損傷
作者通過對比7組小鼠腎臟外觀，HE、PAS、PASM染色和透射電子顯微鏡下腎臟組織結構形態圖，糖尿病組小鼠腎臟增大，組織形態異常，系膜區擴張，細胞外基質(ECM)積聚，基底膜增厚，足細胞形態異常，足突融合缺失。陽性藥物組和YJHD-H組能夠明顯減輕糖尿病小鼠腎臟損傷。
 

圖3. YJHD減輕腎組織學損傷

4.YJHD改善腎纖維化
作者通過腎組織染色、qPCR、Western blot和免疫組織化學方法檢測了ECM的主要成分IV型膠原和纖維連接蛋白的表達水平。發現與糖尿病小鼠相比，YJHD-H組腎臟膠原纖維數量明顯減少，腎纖維化程度明顯改善，并且顯著降低腎臟IV型膠原和纖維連接蛋白表達。證實了YJHD-H有效減緩糖尿病腎病小鼠腎臟纖維化。
 

圖4.YJHD改善腎纖維化

5.YJHD減輕足細胞損傷
作者通過透射電鏡觀察小鼠細胞形態，糖尿病腎病小鼠足細胞形態受損，足突融合，而對照組則顯示正常的細胞形態。此外，測定各組足細胞的podocin和neparin表達，其在糖尿病組表達顯著降低，證實了糖尿病組小鼠足細胞減少。陽性藥物組和YJHD-H 均能促進其表達，從而減輕足細胞損傷。表明YJHD-H小組能夠減輕糖尿病腎病小鼠足細胞損傷。
 

圖5. YJHD可減輕足細胞損傷

6.YJHD促進自噬
作者通過評估對細胞自噬起重要作用的Beclin-1、p62和LC3II基因的mRNA和蛋白表達水平來評估自噬程度。發現糖尿病組小鼠自噬受到抑制，YJHD-H 組通過上調Beclin-1和LC3II的表達，下調p62的表達促進自噬，推測這可能是其減輕足細胞損傷的機制之一。
 

圖6.YJHD對自噬的影響

7.YJHD對mTOR通路的影響
mTOR途徑是調節自噬的關鍵途徑，激活的mTOR磷酸化ULK1抑制足細胞自噬。作者測定了mTOR、p-mTOR及其下游的ULK1和p-ULK1在腎臟中的表達水平。糖尿病小鼠mTOR、p-mTOR和p-ULK1表達顯著增加。與其相比，YJHD-H組mTOR、p-mTOR和p-ULK1表達顯著降低，結果揭示了YJHD-H組可抑制mTOR通路的激活。
 

圖7.YJHD對mTOR通路的影響

8.YJHD對PI3K/Akt和AMPK通路的影響
mTOR途徑主要受PI3K/Akt和AMPK途徑調控。作者測定了腎臟中PI3K/Akt和AMPK途徑蛋白的表達。與糖尿病組比，YJHD-H組小鼠通過降低IRS1和p-Akt表達，抑制PI3K/Akt通路，這與抑制mTOR通路的作用一致。AMPK通路對自噬有正向調節作用，這與抑制mTOR通路激活有關。與糖尿病組比較，YJHD-H組小鼠通過LKB1和p-AMPK的表達，激活AMPK途徑。
 

圖8. 對PI3K/Akt和AMPK通路的影響


 

圖9. 自噬過程示意圖