慢病毒（Lentivirus，LV）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）改造而來的一種病毒載體，屬于逆轉錄病毒。慢病毒可將特定基因片段隨機、穩定地整合到宿主細胞的基因組中，實現目的基因的持續穩定的表達目的產物，因此，目前慢病毒載體已經廣泛地應用于基因的表達調控如過表達，干擾和基因敲除。

然而，在做病毒包裝實驗中，科研工作者常遇到一些問題，比如為何我的LV包裝出毒量很低？包裝出來的LV感染細胞效率低？感染細胞后生長狀態差等，下面就由賽業生物細胞生物學產品經理為大家解答這些常見的問題。

為何我的LV包裝出毒量很低？
為什么都是采用同樣的慢病毒包裝系統，別人次次成功，我的不是滴度低就是穩定性差？這是因為除了包裝系統本身，LV的包裝還與下列幾個因素密切相關：
1) 細胞狀態：LV的包裝一般使用293T細胞，293T細胞的活力、生長狀態，是否處于對數生長期、鋪板是否均勻等對病毒的產量影響很大，并控制轉染前密度為50~60%。

2) 目的基因：目的基因的大小、序列及翻譯的蛋白是否含有毒性均會影響包裝效果；例如，若目的片段較大（＞2.5k），則可能會導致包裝滴度下降，甚至無法包裝。某些過表達會產生細胞毒性的蛋白，可能會導致細胞異常從而出毒量低（可考慮更換為腺病毒）。

3) 質粒質量：做好陰性對照（GFP組），確保包裝目的基因的載體構建的完整性，并做好純化。

4) 收毒時機：轉染后24、48h觀察細胞生長狀態及熒光狀態，生長狀態良好一般于48h第一次收集病毒上清，換液后于72h再次收集病毒上清。

包裝出來的LV感染細胞效率低？
理論上LV感染細胞的能力很強，而且能感染分裂和非分裂期的細胞，但為什么我的感染效果總是不理想？影響LV感染效果的因素有哪些？
1) 細胞類型：有些細胞本身就較難被感染，如某些原代細胞，可考慮加大病毒量或采用濃縮病毒進行感染。

2) 細胞生長狀態：感染細胞前，需要保證細胞處于良好的生長狀態，以及合適的生長密度，細胞膜的流動性、與細胞表面的接觸面積及表面受體的表達豐富等均會影響病毒感染細胞的效果；另外對于懸浮細胞，可以采用離心感染的方法。

3) 病毒質量：包裝出來的LV應盡量避免凍融，反復凍融會降低病毒的滴度（每次約降低10%），若一次用不完建議分裝后儲存于-80℃，但即使-80℃也不建議超過6個月；對于4℃保存的LV則盡量3天內用完。

另外，也可考慮加入Polybrene助感染試劑增強感染效果，但Polybrene本身具有細胞毒性，謹慎使用。

細胞感染后生長狀態差？
我們用LV感染細胞是為了進行后續一系列的功能研究，結果感染后細胞生長狀態很差完全無法繼續實驗，這是什么原因？有什么辦法呢？
1) 純化病毒：病毒溶液中殘留的雜質蛋白、內毒素及宿主細胞DNA等都有可能造成細胞毒性，嚴重時可能導致細胞死亡。

2) 調整病毒滴度：MOI值是LV感染實驗非常重要的一個指標，我們應在確保細胞狀態不受影響的情況盡可能用最少的病毒量。某些對病毒比較敏感的細胞，過高的滴度會嚴重影響細胞狀態，可通過預實驗，確定病毒感染的最佳MOI值。

3) 外源基因過度表達：如果過度感染使得外源基因過度表達，可能導致目的細胞代謝失衡從而影響生長狀態。

如何確定慢病毒MOI值？
MOI即感染復數，一般將細胞有80%被感染時所用的病毒顆粒數和細胞數目的比值作為該株細胞的MOI。MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細胞個數

1) 查文獻：通過高分文獻報道確定MOI值。

2) 設計梯度預實驗摸索：以文獻推薦梯度上下各設置2個梯度，每個梯度至少相差兩倍，例如文獻推薦MOI值為8，則設置為2-4-8-16-32。

3) 梯度感染后，選取細胞狀態較好、熒光較多的，或者藥物篩選后細胞存活率較高的梯度作為使用的MOI值。

怎么檢測慢病毒滴度呢？
滴度（Titer）：單位體積中有感染能力的病毒數目；單位：TU/mL（活性滴度單位）。

通常來說LV滴度檢測：越準確，就越花時間；越省事的，就越不準確。根據并不是所有的實驗要求都需要精確檢測，例如對于構建基因穩定過表達或干擾表達（shRNA）的細胞株，由于有后續的篩選的過程，就可采取快速檢測法（死病毒也會檢測出來）。

LV滴度的快速檢測包括QPCR，ELISA和試紙法。其差異在于，QPCR法：檢測病毒核酸量；ELISA法：檢測病毒衣殼蛋白量；試紙法：檢測病毒p24衣殼蛋白含量。

而對于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究，則需要精確檢測LV的滴度，包括熒光報告基因法和抗生素篩選法。

為什么我用LV做基因的干擾表達效果不好？
對于干擾慢病毒，提高病毒量對干擾效果一般不會有改善效果。干擾效果差一般來說是由以下幾個原因導致的：

1）shRNA的特異性：shRNA設計而導致的脫靶效應，重新設計shRNA。

2）干擾機制：促進mRNA降解還是抑制翻譯？

3）細胞反饋機制：某些基因表達水平降低會導致核糖體翻譯效率上升，表達水平上升。

4）結果判讀建議以蛋白為準。

LV過表達效果差？
在我們用LV進行過表達時，常出現以下2種情況：

1) 目的細胞無熒光信號但平行293細胞有信號。出現這種情況最可能的原因為目的細胞不易感，屬于難感染細胞，建議適當加大病毒量再嘗試。

2) 目的細胞有熒光但目的基因表達無增強。說明轉染沒問題，且熒光啟動子正常工作，若目的蛋白與熒光蛋白是否為同一啟動子，包裝前可做啟動子活性篩選；另外，考慮目的蛋白是否對細胞有毒性，使得目的蛋白被細胞降解。

另外，對于過表達效果差的一般處理辦法，可采取：提高病毒滴度、更換載體、避免基因反饋（細胞適應）、以及采用誘導表達的方式。

LV如何介導多個基因同時表達？
1) 若目的基因片段不大，可采用雙向/多啟動子分別單獨啟動多個基因。

2) 若目的基因片段較大，可采用單一啟動子啟動多個基因表達（蛋白融合）。

3) 在不同基因間插入IRES。

4) 在不同基因開放閱讀框中插入蛋白酶剪切位點。

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