在我們研究基因功能的時候，基因敲除（Knock out，KO）是實現基因loss of function的重要調控方式。相比于傳統的基因干擾（RNAi）技術，基因敲除可完全消除目的基因的表達，最終使其蛋白完全不表達或功能徹底喪失，也讓我們可以更好地觀察細胞表型的變化。

但對于基因敲除細胞模型你可能存在許多疑惑，賽業生物細胞生物學產品經理整理了部分關于基因敲除細胞模型大家常問的問題并做出了解答。看看你的問題是否已在下面得到解答。如果你還有其他問題需要解答，歡迎聯系我們。

Q1  實現基因loss of function，我是要做敲低（RNAi）還是敲除？

A:
1）當敲除可能會導致細胞增殖非常緩慢或停止生長，或在細胞轉染后的cell pool階段檢測效率呈顯著下降趨勢，即可判定可能出現敲除致死的情況，建議用RNAi；

2）由于存在部分強功能蛋白，即使表達下調了，仍然有較強的功能，如果RNAi始終做不出表型，但從有關信息推測這個基因很大可能性會出表型，建議做KO；另外，研究目的基因處于非轉錄區域，或者目的基因有很強的轉錄效率，也是無法用RNAi進行有效干擾的，則只能做KO，且KO細胞更適合進行回補實驗；

3）最后，敲低跟敲除不是二選一的關系。當我們用RNAi做了基因敲低，觀察到細胞表型的變化后，仍然可以進一步做敲除，讓實驗結論更加有說服性。

Q2  KO單克隆與KO cell pool的區別？
A:
KO單克隆是指所有細胞均由一個測序驗證的純合子細胞增殖而來的，所有細胞的基因型都是一樣的。KO cell pool是指沒經過單克隆化和篩選的細胞池，因此可以理解為這群細胞中包含KO純合子，雜合子和野生型，我們在拿到KO cell pool后須根據后續的實驗需求挑取單克隆。

當需要去除細胞群體干擾因素的時候，推薦使用單克隆穩定細胞株，其基因組背景相對單一，對實驗結果干擾因素小。當進行系統生物學研究時，需考慮細胞群體因素，同時由于不同細胞個體差異大，而且不同整合位點的單克隆細胞株表現出來的細胞行為可能不一致，所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。因此，選擇單克隆細胞株還是混合克隆細胞株，需要根據實驗目的而定。

Q3  移碼突變和片段敲除哪個能更好的破壞目的蛋白的功能結構域？

A:
雖然主觀上我們很容易認為片段敲除對于蛋白功能域的影響更大，但其實移碼跟片段敲除很多時候均可以達到理想的敲除效果。

無論是片段敲除還是移碼突變均要考慮敲除片段是否為非3的倍數。即片段敲除除了要考慮敲除的片段區域之外，也要考慮敲除的區域能否引起移碼突變。如果敲除的片段不能引起移碼突變，蛋白僅僅是缺失了敲除區域對應的氨基酸序列，但蛋白的其他區域并不受影響。
 

Q4  是否可以一定確保蛋白不表達？

A:
首先保證蛋白不表達從科學的角度上來講，無論是采用移碼突變還是片段敲除都不可能什么細胞或基因都保證蛋白不表達。例如移碼突變的mRNA可能發生可變剪切，直接跳過移碼部位進行翻譯，導致蛋白有表達；或者蛋白表達功能域的位點剛好處于切割位點更靠前的區域等。

因此我們不會草率地說我們保證蛋白不表達，這是有悖于科學原理的，但我們可通過最優的gRNA設計，從根源上避免蛋白殘留問題，再結合抗體分析，及實驗過程中階段性WB測試，為您提供科學的解決方案，讓您不再為KO細胞蛋白殘留問題而發愁。

Q5  如果要做KO的回復實驗，該怎么設計方案？

A:
首先，需要做回復實驗的KO細胞，其建立不建議穩轉gRNA+移碼的策略，這是由于Cas9持續表達，gRNA又是作用于外顯子上的體系，回復的時候移碼突變必須要做cDNA的突變，也就是同義突變，將CRISPR識別的PAM序列去掉，否則cDNA也會被切割掉。另外，片段敲除則是2條gRNA在內含子上切割，在cDNA上沒有識別切割位點，所以再進行過表達的回復實驗就相對比較順利。

賽業生物細胞基因編輯技術

Smart-CRISPR™

賽業生物獨創Smart-CRISPR™技術，是基于人工智能的AlphaKnockout基因編輯專家系統和CRISPR/Cas9技術自主開發的細胞基因編輯系統，相比普通CRISPR/Cas9技術的基因切割效率更高，可輕松實現細胞移碼突變、片段敲除、多基因敲除等多種敲除策略，更好地解決蛋白陽性殘留等問題，基因編輯效率顯著提升，助力您發文更快速！歡迎大家聯系我們咨詢~