2018年2月7日，華盈生物合作伙伴上海中醫藥大學楊永清教授研究團隊在完成的新研究中指出，臨床有效的針刺抗哮喘治療方法可顯著提高金屬硫蛋白-2 (MT-2)蛋白含量，其受體TG2是治療哮喘的新靶標。該研究不僅在針灸效應物質基礎研究方面取得了重大進展，更為哮喘病治療藥物的開發開啟了大門。這一項突破性研究結果作為封面文章發表在2018年2月7日出版的頂級學術期刊《Science Translational Medicine》上。這是繼2017年針灸治療臨床試驗相關文章發表在國際期刊JAMA之后， CNS刊登的首篇針灸機理研究文獻。
 

研究背景簡介
 

       哮喘是當今世界上常見的氣道慢性炎癥疾病之一，該病的發生與遺傳因素、環境因素、呼吸感染等諸多因素相關。期間會有氣管狹窄，導致后續肺阻力的出現，而舒張氣管平滑肌細胞是緩解氣喘，降低肺阻力的有效途徑。臨床上防治哮喘的藥物主要有β2受體激動劑、抗膽堿藥、糖皮質激素等。然而這些藥物本身具有不用程度的副作用，而且長期攝入可以導致耐藥性增加，使病情無法緩解。因此迫切需要開發新的哮喘治療藥物。
 

       在中醫界，幾十年來年來運用針刺大椎、風門等穴位，可以顯著改善哮喘患者呼吸功能。針刺具有多靶點效應，為挖掘針灸改善哮喘深層機制，楊永清教授研究團隊將研究重點聚焦在了金屬硫蛋白2（MT-2）上，MT-2屬于金屬硫蛋白家族，通常在氣管上皮細胞和平滑肌細胞中保守表達。雖然已有報道證實金屬硫蛋白在內毒素血癥中能保護肺部的氧化應激，但尚未發現MT-2在哮喘研究方向的相關報道。楊教授研究團隊以MT-2為研究起點，在其對哮喘的治療應用方面展開了系統性研究，見圖1。
 

圖1  技術路線

文獻解讀
 

• MT-2：有效快速治療哮喘，降低肺阻力

   

        雖然臨床針刺可以顯著防治哮喘，但具體機制研究并不明確。為了首先理清哮喘發病機制，研究人員建立了OVA誘導大鼠過敏性哮喘模型，并分析了肺組織中MT-2蛋白表達水平，發現哮喘模型組中MT-2表達量下降超過50%。
 

金屬硫蛋白水平的下調是不是哮喘發生的原因呢？
 

        為驗證這個推測，科研人員通過基因敲除手段驗證了MT-KO小鼠哮喘的易發性，發現MT敲除小鼠比哮喘模型組有更高的肺阻力！應用重組MT-2蛋白進行反證的結果與之高度呼應：通過頸外靜脈注射MT-2到哮喘大鼠體內可以顯著降低肺阻力！同時，研究人員還將MT-2與FDA批準的哮喘治療藥物特布他林(TB）和氫化可的松(HC)進行了比較，發現0.1 μg/kg 的MT-2即可達到劑量高達550倍，甚至150000倍的傳統哮喘治療藥物的效果。更讓人不可思議的是，肺阻力在注射MT-2后的3分鐘-8分鐘就有顯著下調，并且MT-2可以更加有效地降低乙酰膽堿（ACh）引起的氣管平滑肌細胞（ASMCs）的收縮。如此的低劑、高效的MT-2讓研究人員振奮不已！見圖2。
 

圖2  MT-2能有效快速治療哮喘

• TG-2：MT-2結合受體發現

   

MT-2能有效治療哮喘，是否需要通過結合下游受體發揮治療效果？
 

        研究人員通過共聚焦觀察，發現MT-2定位到ASMCs細胞膜上。通過進行MT-2與ASMCs結合分析，證實存在受體介導MT-2和ASMCs的結合。為找到這個中間受體，科研人員采用傳統的pull down + LC-MS/MS技術，鑒定到細胞膜中與MT-2結合的兩個蛋白：Enolase-1和TG2。但在進一步的競爭性結合實驗中發現，只有TG2的阻斷抗體能抑制MT-2和ASMCs的結合，因此將研究重心鎖定在MT-2結合受體TG2上。后續的系列細胞結合檢測、共聚焦觀察、分子動力學SPR分析結果均證實MT-2能在ASMCs細胞膜上結合受體TG2。
 

圖3  MT-2特異性結合受體TG2

• MT-2—TG2：MT-2通過TG2舒張ASMCs 

   

        為進一步確證TG2對MT-2有效舒張ASMCs能產生影響，科研人員通過基因敲除手段分析了MT-2對TG2-KO鼠ASMCs的影響。發現一旦敲除TG2，MT-2對ASMCs的有效舒張也隨之消失，且過敏性哮喘模型鼠更易發生哮喘！
 

        MT-2通過結合TG2舒張ASMCs的內在機制是怎樣的呢？
 

        楊永清教授研究團隊對MT-2可能參與影響的信號通路情況進行了系統性分析。面對細胞內復雜的信號通路，研究人員果斷采用信號通路磷酸化廣譜芯片PEX100（一次芯片實驗即可完成31條信號通路磷酸化調變的全譜篩選），對用MT-2處理的大鼠ASMCs，以及對照組一同進行蛋白芯片檢測。芯片篩選以及WB驗證結果均顯示MT-2很大程度的誘導Ezrin的磷酸化和MYPT1的去磷酸化水平。后續的Co-IP和SPR實驗證實Ezrin是只能跟TG2共結合的蛋白。根據已有報道，Ezrin是一種細胞骨架蛋白，參與膜受體復合物的穩定。研究人員推測Ezrin可能通過調節TG2定位和肌動蛋白細胞骨架相互作用，最終助力MT-2舒張ASMCs，見圖4。

 

圖4  MT-2通過TG2舒張ASMCs

• TSG12：TG2激動劑的篩選與評價應用

       鑒于MT-2通過TG2舒張ASMCs，TG2作為哮喘治療新靶標，是否可以開發TG2激動劑來治療哮喘呢？

       楊教授研究團隊與中科院上海藥物研究所所長蔣華良早在2003年就成立“針灸中藥效應聯合實驗室”，他們繼續展開了緊密合作。利用分子對接等技術從6000個化合物中篩選TG2結合分子，并對排名前21的化合物逐一進行SPR分子動力學的驗證工作，其中化合物TSG12展現出Z大強度的特異性結合TG2的能力。后續研究人員通過系統的細胞學和動物學實驗，對TSG12進行了藥效評價。結果顯示：注入小鼠體內的TSG12主要在氣管和肺部積累，其可以通過TG2促進ASMCs的舒張，有效舒展氣道，降低肺阻力，從而達到哮喘治療效果。在分子機制研究層面，研究人員以蛋白芯片篩選結果中MYPT1的去磷酸化為研究線索，通過WB實驗證實TSG12的處理也可以誘導MYPT1Thr853的去磷酸化。已知MYPT1Thr853可以激活下游的MLCP,去磷酸化MLC，最終導致肌肉舒張。同時，研究人員也對MYPT1Thr853的上游進行驗證分析，發現TSG12可以誘導RhoASer188的磷酸化和ROCKTyr722的去磷酸化水平。最終，研究人員將整個分子機制串聯起來，TSG12可以抑制RhoA（已知RhoA的磷酸化可以抑制RhoA），通過調節RhoA-ROCK-MYPT1-MLC通路促進MLC去磷酸化，最終舒張ASMCs，見圖5。

 

圖5  TSG12治療哮喘表型和機制分析

 

       最后，研究人員在哮喘模型動物中對TSG12的哮喘治療效果做了進一步驗證評價。證實具有TSG12能有效舒張氣管平滑肌，顯著降低肺阻力，具有“類針刺”作用效果。與臨床防治哮喘藥物β2受體激動劑相比，TSG12對TG2受體并沒有產生脫敏影響，是一種效果極其優秀的哮喘治療新藥物，具有良好臨床應用前景，如圖6。

 

圖6  TSG12哮喘治療評價
 

小結：
 

        本研究不僅是中醫藥基礎生物學研究領域的代表案例，也為所有臨床相關基礎生物學研究提供了經典的思路：從臨床總結中發現科學問題——利用蛋白組學等實驗手段理解相關機制——提出改善臨床問題的新方案。值得一提的是，蛋白質是大多數藥物治療的靶點，也是針灸等傳統醫療手段的效應物質。本文以尋找替代針灸治療的藥物靶點為出發點，一開始即進行了一系列的蛋白質篩選和鑒定工作，目標明確，成果顯著，值得推廣。

英文文獻原文：http://stm.sciencemag.org/content/10/427/eaam8604