腫瘤的發生、發展以及轉移與糖鏈的表達密切相關。一些腫瘤細胞糖基化修飾的改變能夠影響細胞的周期調控和細胞的增殖能力，促進腫瘤的發展，但具體分子機制尚不清晰。來自美國紐約大學醫學院的科研小組借助糖基化研究新工具——凝集素芯片，發現腫瘤轉移相關驅動因子，進而找到其上游調控因子以及下游靶向因子，揭開了黑色素瘤轉移機制，相關結果發表在國際頂級學術期刊Cancer cell上（PMID: 28609658）。

 
技術背景——凝集素芯片介紹

凝集素（Lectin）是一類自然界廣泛存在的蛋白質，具有特定糖結構識別的特性。利用凝集素進行特定糖結構的解析是糖生物學研究領域的常用手段。凝集素芯片是將多種經典凝集素以微陣列的形式固定在高分子三維芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可進行多種糖結構的同步篩選和交叉驗證。

1、凝集素芯片篩選糖基化譜

首先，研究人員通過凝集素芯片對臨床黑色素瘤樣本進行差異糖蛋白篩選。重點分析黑色素瘤原發灶和轉移灶中糖基化差異，找到了發生顯著變化的四種糖基化修飾（綠色方框表示該糖基化在原發灶中高表達，轉移灶中低表達；紅色方框表示該糖基化在原發灶中低表達，轉移灶中高表達。同時，研究人員從TCGA、GEO數據庫中提取獲得相對應的糖基化基因的表達水平數據，見圖1。（PS: TCGA (The cancer genome atlas)是目前重要的癌癥基因信息數據庫，其主要收錄各種人類癌癥的臨床數據，基因組變異，mRNA表達，miRNA表達，甲基化等數據，是癌癥研究者很重要的數據來源。GEO數據庫（Gene Expression Omnibus)是NCBI的基因表達數據庫，也是當今比較全面的公共基因表達數據資源。）
 

圖1 黑色素瘤原發灶和轉移灶中糖基化檢測與糖基因表達水平分析

 

2、體外實驗：糖基化基因功能驗證
        隨后，科研人員在黑色素瘤細胞系中，應用siRNA技術對先前篩到的差異糖基化基因進行功能驗證。細胞侵襲實驗結果證實FUT1、FUT2的沉默促進腫瘤轉移，而抑制FUT8后，腫瘤轉移明顯下降。免疫熒光和免疫組化結果顯示：轉移灶中凝集素LCH等識別的N核心巖藻糖基化（糖基化基因為FUT8）表達明顯升高，而凝集素UEA-I等識別的α-1,2巖藻糖基化（糖基化基因為FUT1/ FUT2）表達顯著降低，見圖2。
 

圖2 體外實驗驗證糖基化基因功能

 
3、體外&體內實驗：糖基化基因FUT8功能確證
        對于藥物開發來說，在轉移灶中上調的指標FUT8相對更容易作為藥物靶點。因此，研究人員后續重點關注FUT8，推測FUT8可能是腫瘤侵襲轉移的驅動子。進一步，通過體外和體內實驗發現，敲減FUT8，細胞侵襲受到抑制，黑色素瘤體內侵襲能力也有明顯下調，證實FUT8的表達與腫瘤轉移侵襲密切相關，如圖3。
 

圖3 糖基化基因FUT8功能確證

4、FUT8上下游轉移機制研究
        研究人員采用Matinspector software轉錄因子預測軟件結合ChIP Enrichment Analysis database找了一系列FUT8上游轉錄因子，并通過siRNA實驗，證實TGIF2作為上游轉錄因子，調控FUT8的表達，見圖4。
 

圖4 FUT8上游調控因子分析

研究人員選取3株不同的黑色素瘤細胞系，通過核心巖藻糖凝集素pull-down結合MS鑒定，鑒定到三個樣本中共同擁有的114種巖藻糖基化修飾的蛋白。進一步進行GO分析，發現一系列與細胞運動遷移相關的蛋白，如L1CAM、NRP2，見圖5。
 

圖5 FUT8下游靶向控因子分析

 
5. FUT8靶向L1CAM 促進腫瘤轉移侵襲

根據前期文獻報道，L1CAM與黑色素瘤發展密切相關，因此研究人員推測FUT8可能通過促進L1CAM的巖藻糖基化來促進腫瘤轉移。實驗結果顯示：在過表達L1CAM的腫瘤細胞中敲減FUT8，L1CAM核心巖藻糖基化程度下降，侵襲能力下降；過表達FUT8，敲減L1CAM可以明顯抑制腫瘤侵襲。L1CAM的N核心巖藻糖基化可以保護其不被蛋白酶識別剪切，從而促進了腫瘤細胞的轉移，如圖6。
 

圖6 FUT8靶向L1CAM促進腫瘤轉移侵襲

 

小結：

在這項研究中，研究人員應用凝集素芯片，找到黑色素瘤轉移灶中高表達的4種糖基化修飾類型。進一步根據差異糖基化尋找糖基化差異基因，發現FUT8參與黑色素瘤轉移。TGIF2調節FUT8的轉錄促使在轉移灶中的高表達，而FUT8介導L1CAM的N核心巖藻糖基化水平上升，導致plasmin無法識別L1CAM，失去對L1CAM的水解作用，而全長的L1CAM可以促進腫瘤轉移，如圖7。關于凝集素芯片，我們經常看到的報道都是疾病標志物相關的研究。本文通過凝集素芯片進行深入的腫瘤轉移機制研究，說明了糖基化基因可以成為驅動腫瘤侵襲轉移的癌基因，為腫瘤及其他疾病深入機理探索提供了新的切入點和研究思路，值得推薦。
 

圖7  FUT8促進腫瘤轉移侵襲模式圖

華盈生物作為中國蛋白芯片行業的標桿企業，我們著力打造蛋白芯片全產品線和系統性解決方案。我們提供的凝集素芯片覆蓋有55種常見凝集素，能夠為疾病機理研究、疾病標志物研究、糖修飾組研究等提供強大技術支撐。

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英文文獻鏈接：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28609658