中國科學技術大學吳緬教授團隊多年來在腫瘤細胞凋亡/生存的信號轉導及分子機制，非編碼RNA調控腫瘤發生發展的分子機理，p53與細胞代謝及誘導性多能干細胞調控的分子機制方面做出了很多開創性的研究成果。近期，研究團隊應用Arraystar Human LncRNA Array對帶有WT p53表達系統以及沒有p53表達的H1299人肺腺癌細胞的lncRNA表達譜進行了研究，研究篩選出了一個受p53調控的lncRNA GUARDIN，一系列功能機制實驗研究表明p53響應的lncRNA GUARDIN對穩定狀態下和暴露于外源性遺傳毒性脅迫后維持基因組完整性非常重要，GUARDIN主要通過競爭性結合miR-23a調控TRF2的表達，以及作為支架分子促進BRCA1和BARD1的結合維持BRCA1的穩定性來發揮相應功能。該研究表明GUARDIN可以作為癌癥治療的潛在新靶標，相關研究成果發表在國際著名學術期刊Nature Cell Biology（IF =20.06）雜志上。（芯片實驗由康成生物提供技術服務）

研究背景

基因組穩定性的維持是一切生命活動的基礎，DNA損傷和復制應激都將影響基因組的穩定性。研究顯示，DNA損傷應答及修復的失調與腫瘤的發生、發展有密切的關系。為了應對代謝活動或者環境損害導致的DNA損傷，細胞會不間斷激活DNA損傷應答（DDR），識別和修復DNA損傷以維持基因組穩定性。腫瘤抑制因子p53是DDR重要的調控因子，通過細胞周期阻滯促進DNA修復，并通過誘導細胞凋亡消除具有嚴重DNA損傷的細胞，維護基因組的穩定，從而抑制腫瘤的形成。p53的轉錄靶點包含廣泛的蛋白質編碼基因，最近的研究揭示了許多長鏈非編碼RNA（lncRNA）能參與調節對DNA損傷的p53依賴性應答，然而關于lncRNA是如何介導了腫瘤抑制因子p53的DNA修復功能目前仍然不是很清楚。

本研究中作者利用Arraystar lncRNA芯片發現了一種p53響應的lncRNA GUARDIN對于維持基因組穩定性是非常必要的。 GUARDIN主要是通過兩種分子作用機制來維持基因組的穩定性：第一、作為分子海綿吸附miR-23a調控端粒重復序列結合因子（TRF2）的表達來維持染色體末端結構的完整性；第二、作為分子支架促進BRCA1與BARD1的結合進而調控BRCA1的表達進而維持細胞的DNA修復能力，GUARDIN對于細胞存活和增殖也是必不可少的，因此，GUARDIN在癌癥治療中也有非常重要的研究意義。

研究思路

首先作者應用Arraystar Human LncRNA Array對帶有WT p53表達系統以及沒有p53表達的H1299人肺腺癌細胞的lncRNA表達譜進行了研究，研究篩選出了一個受p53調控的lncRNA GUARDIN。qPCR驗證與芯片結果一致，生信分析發現GUARDIN有三個異構體，其中最長的亞型在p53誘導時含量最豐富。接下來作者通過過表達/敲除p53、qPCR、WB、免疫沉淀等實驗驗證了GUARDIN是p53響應的lncRNA。

隨后作者對GUARDIN的功能進行了研究，HTC116細胞中，敲除GUARDIN，細胞數目、細胞活力、克隆形成及異種移植物都明顯下降，表明GUARDIN是細胞存活和增殖所必需的。

最后作者對GUARDIN的分子機制進行了研究。GUARDIN主要定位于細胞質中，因此作者通過miRDB數據庫對其結合的miRNA進行了分析，發現GUARDIN可以結合miR-23a，隨后通過miR-23a模擬物/抑制劑熒光素酶報告檢測及pull down等實驗證明GUARDIN可以結合miR-23a且主要發生在細胞質中。同時通過敲除GUARDIN及anti-miR-23a發現，GUARDIN可以調控miR-23a的靶基因TRF2的表達。接下來作者通過RNA pull down結合質譜以及RIP、WB等實驗，發現GUARDIN可以和BRCA1以及BARD1相互作用，通過敲除及突變GUARDIN外顯子實驗，證明GUARDIN可以作為分子支架介導BRCA1與BARD1的相互作用來調控BRCA1的表達。然后作者通過DNA損傷彗星實驗發現，GUARDIN敲除后，DNA損傷加劇等，表明了GUARDIN對基因組穩定性的作用，而且TRF2和BRCA1共同過表達可以消除GUARDIN下調引起的DNA損傷。上述實驗表明GUARDIN可以通過調控TRF2和BRCA1的表達促進基因組穩定性。

技術路線

結果展示

圖1 芯片篩選lncRNA驗證及GUARDIN受p53調控分析結果

圖2 GUARDIN功能研究結果，對細胞存活和增殖是必需的

圖3 GUARDIN機制研究結果，可競爭性結合 miR-487b調控TRF2表達以及介導BRCA1和BARD1互作調控BRCA1表達

圖4 GUARDIN機制研究結果，通過調控TRF2和BRCA1維持基因組穩定性

研究意義

在這項研究中，研究人員通過Arraystar lncRNA芯片篩選出了p53響應的lncRNA GUARDIN，通過一系列功能機制實驗表明GUARDIN競爭結合mi-23a促進TRF2表達，維持染色體末端結構的完整性，GUARDIN促進BRCA1與BARD1的結合而穩定BRCA1，維持細胞的DNA修復能力。GUARDIN對細胞存活和增殖也是必需的，具有潛在的抑癌效應，可能成為癌癥臨床藥物治療的潛在靶標。

原文出處

GUARDIN is a p53-responsive long non-coding RNA that is essential for genomic stability. Nature Cell Biology, 2018