第一節 老年癡呆的定義

阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD），又稱老年性癡呆，是一種與衰老相關，以認知功能下降為特征的漸進性腦退行性疾病或綜合癥。病人整個大腦彌散性萎縮并出現明顯的病 理組織學改變——老年斑（senile plaque, SP）（或神經炎性斑，neuritic plaque）和神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle, NFT)。病人認知功能下降并伴有神經元功能障礙、神經元數量減少、神經元體積擴大及突觸缺失（I型營養障礙軸突）和胞內磷酸化 tau（microtubule-associated protein tau）形成的成對螺旋絲，即NFT（II型營養障礙軸突）。此外，胞外的淀粉樣蛋白（amyloid β-protein, Aβ）沉積形成SP，其周圍環繞著營養障礙的突起。Aβ沉積形式由早期的彌散型聚集（不成熟的彌散斑）到形成成熟的致密斑，后者由直徑為8nm的原纖維組 成，用剛果紅染色后在偏振光的照射下表現出雙折射的特性。晚期的病理變化是由激活的小膠質細胞和星形膠質細胞參與的炎性反應所引起的，它們包圍著沉積斑 塊。該病早期的行為學改變為輕微的記憶紊亂或個性改變，在5~10年內逐漸惡化，最終出現嚴重癡呆癥狀，生活不能自理。這種隱襲和破壞性的大腦退行性疾病 剝奪了受害者最具人類特征的品質——記憶、推理、抽象化和語言的能力。

一、臨床癥狀

AD幾乎都是以不可覺察的方式開始發病，最初常常是偶然地、在回憶日常生活最近事件時遇到困難。病人可能無法回憶與某個人的交談或參與過的某項活動，或者可能是對最近接受的某個項目的信息變得很迷惑，亦即以輕微認知障礙 (mild cognitive impairment，MCI)為先兆。患者往往是以純粹的遺忘癥狀開始，其他認知方面很少或根本沒有任何困難[1]。MCI或早期AD患者完全保持清醒狀態，沒有明顯的語言混亂，并保持著正常的運動和感覺功能。

AD發病的最初幾年，多數病人在一般認知功能方面即已出現一些問題，例如在時間感和空間感及進行正確自如的復雜操作方面屢屢出錯，并出現用詞和數學運算困 難等。當這些輕微的差錯變得逐漸引人注意時，病人可能對一些活動和愛好變得索然無趣、出現情感淡漠、情緒不穩定了。在漸進性的記憶和認知功能衰退后，許多 病人開始經歷第一次、然而是比較明顯的運動功能障礙，包括手工操作、寫作、繪畫、正常行走等。在幾年或十幾年的病程中，AD會逐漸惡化到明顯癡呆的地步。 由于定向力完全喪失、記憶力嚴重缺損及認知功能障礙，許多病人活動受限，被迫常常坐著或躺著，最后可能死于某些小的呼吸系統疾病，如誤吸或肺炎等。

二、神經病理學特征

雖然基于上述的體癥和癥狀一般能對AD病人做出臨床診斷，但確診仍需死后做病理切片檢查。在AD患者海馬、杏仁體、額葉、顳葉及頂葉皮質的病理切片中均可 觀察到典型的病理損害。雖然大腦半球輕度萎縮（8% ~15%）能通過肉眼觀察到，但這并不比非癡呆的個體發生得嚴重。但光鏡下，AD病人的上述腦區顯示出SP和NFT。SP略成球形，Aβ纖維沉積在胞外， 周圍被潰變的軸突與樹突、激活的小膠質細胞和星形膠質細胞包圍著。許多SP所在的腦區還可見到伴隨著的星星點點的“彌散”斑塊。在這些無定形、Aβ免疫反 應呈陽性的小斑塊中通常缺乏Aβ纖維，幾乎不含或僅含有極少的潰變突起或異常的膠質細胞。在大多數的AD患者中，彌散斑的數量明顯地超過SP的數量。彌散 斑似乎是光鏡下可檢測到的AD大腦中的最早病理變化。它們的發生先于SP，它們也發生在認知功能正常的、中年晚期和老年健康人的大腦里[2]，就象唐氏綜 合癥病人在發展成典型的AD樣SP和NFT以前所具有的病理改變那樣。實際上，皮質中的彌散斑與SP存在著形態學上的連續性，而不應當作界限清楚的兩種類 型的病理損害。

除了SP，另一個診斷AD病理損害的指標是NFT。NFT為雙螺旋絲結構，通常與直線絲混雜在一起，位于邊緣系與皮質神經元細胞核周圍的胞漿內。這些異常 絲可以發生在許多SP中潰變的神經元內，也有一些發生在SP之外；NFT也能在皮質下核團，如內側隔核和基底前腦Meynert核（NBM）膽堿能神經元 中觀察到。這些核團發出纖維廣泛投射到Aβ沉積物豐富的邊緣系和聯合皮質。

近來關于AD的一個新的研究發現，SP也見于一些沒有或僅輕度認知功能障礙的個體。然而，重要的是幾乎所有正常老年腦組織內的SP的類型為彌散斑，也就是 說，這些斑缺乏與Aβ沉積相聯系的神經元和膠質細胞病理改變，同時在相應腦區沒有或很少NFT。根據這些發現，人們推測彌散斑是“臨床前”損害，在顯微鏡 觀察下尚不能觀察到神經元損傷及其過程，就象在大多數無癥狀的老年人體循環血管壁上出現的“脂紋”是臨床上重要的、成熟的動脈粥樣硬化斑的前體一樣。

三、神經遞質改變

AD腦組織中發現的第一個神經遞質異常是乙酰膽堿（Ach），合成和降解Ach的酶活性發生改變[3]。因此，AD內側隔核和基底前腦膽堿能神經元的數量與質量都發生變化。然而，在這些遞質缺乏的同時，很快伴隨著其他遞質神經元的減少或喪失，包括谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、生長抑素 （SST）、促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）和5-羥色胺（5-HT）等等[4]。因此，AD神經遞質缺乏是廣泛性的，并且，還沒有關于各種神經元亞 型遭破壞過程的清晰線索。直到現在，只有膽堿能遞質功能不足被真正用于AD治療。

第二節 老年癡呆動物模型

由于AD的病因與發病機制非常復雜，是環境因素與遺傳因素共同作用的結果，是以漸進性認知功能損害為特征的多病因的疾病或臨床綜合癥，它有其特征性的神經 病理表型和神經遞質表型。所以目前還沒有一個完全具備AD特征的理想動物模型，這大大制約了AD治療藥物的研究。那么什么樣的AD模型才算是理想的AD模 型呢？根據AD的以上特征，筆者認為，理想的AD動物模型應具備以下三個方面的特征：（1）具有AD的主要神經病理學特征——SP和NFT；（2）出現大 腦神經元死亡、突觸丟失和反應性膠質細胞增生等AD的重要病理變化；（3）出現認知和記憶功能障礙。如果哪一種模型能同時符合以上特征，那將是一種很好的 AD模型。目前的動物模型種類很多，但大多只模擬出AD的一部分特征，很難完全具備理想動物模型的特征，難以完全模擬出AD整個疾病的特征。近年來出現的 轉基因動物模型是一大熱點，但也不能完整復制出AD的特征。下面將現有的模型作一介紹。

一、以衰老為基礎的AD動物模型

在生物醫學歷史上，有關AD的話題幾乎沒能引起科學家們多少興趣。這種情況在20世紀下半葉發生了戲劇性的變化，當時美國的人均預期壽命突然從49歲增加 到76歲，使得個體年齡增加到了神經退行性疾病普遍發生的年齡。AD發生于老年人，衰老是AD肯定的危險因素。隨著年齡的增長，AD患病率呈指數升高趨 勢。一般認為，超過65歲，每增加5歲患AD病人的比例就增加一倍。目前世界人口老齡化，該病的發病率進一步增高，使其在老年人群中所占的比例增大。AD 已成為65歲以上癡呆最常見的病因，在發達國家已被認為是一個主要的公眾健康問題。

生命體不同于自然界的一般物體，它能新陳代謝，可以用新的化學物質代替體內舊的化學物質，衰老為什么會發生，它又是如何發生的？目前研究認為，衰老可能與 氧自由基對細胞的損害有關，也有人認為可能是由于細胞線粒體功能障礙引起能量代謝障礙所致，還有人認為是由于與某個控制衰老的基因作用有關。人類如果能了 解衰老的奧秘，那也就從另一方面了解到衰老促使AD更容易發生的機制了，或許人到了一定的年齡都會發生AD，而那些沒有發生AD的老年人可能是還沒有活到 他（她）本人發生AD的年齡。此類模型就是以衰老作為AD發病基礎，通過各種方法促進動物的衰老（包括自然衰老）來達到制作AD動物模型的目的。

（一）自然衰老認知障礙動物模型

通過動物本身的自然衰老來獲得的AD動物模型，包括老齡大鼠、小鼠及猴等。這類模型的認知障礙等神經系統改變是自然發生的，較其他動物模型更貼近AD的真實病理生理改變[5]。但動物難以大量獲得，老齡動物易死亡，并不能保證每一只都具有AD的特征。

（二）快速老化小鼠(senescence accelerated mouse，SAM)模型

竹田俊男[6]通過對AKR/J自然變異小鼠進行近交延代培養得到一種自然快速老化小鼠，該家族諸多品系中的SAM P/8和SAM P/10表現出明顯的學習記憶功能減退，處于一種低緊張、低恐怖的癡呆狀態。

（三）D-半乳糖誘導的亞急性衰老模型

D-半乳糖損害模型是由我國學者首先提出的，動物表現出學習記憶力減退，行動遲緩，毛發稀疏等老化征象。皮質神經元中細胞器減少，線粒體膨脹呈空泡樣變性，粗面內質網脫顆粒，蛋白質合成減少，神經元丟失，這與老年動物的表現一致[7]。

通過模擬衰老過程而得到的動物模型比較真實地再現了AD病理生理改變，與AD有一定的相似性。但衰老只是AD發病的危險因素，并不能保證老齡動物就一定會發生發展成AD，且一般不出現AD的SP與NFT等特征，不易飼養和生存。

二、以膽堿能學說為基礎的AD動物模型

二十世紀七十年代中期，關于AD的第一個神經化學線索來自神經元合成與釋放Ach發生嚴重的退行性變，人們發現在病人邊緣與大腦皮質區域與Ach合成、降 解有關的膽堿乙酰轉移酶（ChAT）和乙酰膽堿脂酶（AchE）的含量與活性下降，并且這些區域伴隨有膽堿能神經元胞體的缺失。換句話說，即內側隔核與基 底前腦膽堿能系統功能降低。這個發現使藥理學家研究聚焦在如何提高突觸間隙Ach的水平，主要是通過抑制Ach的降解來實現。這些努力的最終結果導致膽堿 脂酶抑制劑類的藥物用于治療AD。

現已確認膽堿能系統的活性與人的學習記憶與認知活動過程密切相關。基底前腦膽堿能神經元、海馬和皮層及它們之間的通路，是學習記憶功能的重要結構基礎。 AD患者基底前腦膽堿能神經元大量損傷或死亡、突觸前Ach的合成、ChAT的活性以及對膽堿的攝取能力都明顯下降，這些變化的程度與患者認知功能損害的 程度呈正相關[8]。因此認為腦內膽堿能神經系統的退化是AD學習記憶功能減退的主要原因之一。綜上所述，AD病人中的膽堿能功能減退，與學習記憶密切相 關，是癡呆的重要原因之一，因此逐漸形成了AD發病的膽堿能學說。以這個學說為基礎，人們采用各種方法來破壞動物大腦的膽堿能系統的功能，促使其發生學習 記憶障礙而達到制作AD動物模型的目的。

在哺乳動物腦內，基底前腦NBM是膽堿能神經元存在的主要部位，大腦皮層和海馬中的膽堿能投射纖維有70%來自于NBM。根據AD發病的膽堿能損傷學 說，AD的發生是由于內側隔核與基底前腦膽堿能系統功能降低引起的，該類模型通過定位注射來損毀此區域，以制備基底前腦膽堿能系統損傷的AD模型。該模型 模擬出了AD的認知功能缺陷和基底前腦膽堿能系統廣泛的功能損害。這類模型有：

（一）電損毀、外科損毀

通過對動物進行手術，參照動物腦立體定位圖譜，用電灼傷的方法損毀NBM，外科手術切斷海馬穹隆傘。手術后動物出現了學習和記憶功能障礙，但病理上未出現SP和NFT，且這種方法損毀范圍較大，目前已基本不采用[9，10]

（二）化學損毀

將興奮性氨基酸如鵝膏蕈氨酸(ibotenicacid，IBO)、海仁酸(kainicacid，KA)、使君子酸 (quisqualicacid，QA)和N-甲基-D-天冬氨酸(***A)等注入動物的基底大細胞核可建立AD模型[11]。AF64A是一種膽堿能 神經末梢特異性神經毒素，其結構與膽堿相似，理論上僅為膽堿能神經元所攝取，能選擇性地作用于高親和力膽堿轉運(HAChT)系統。采用立體定位注射的方 法損毀神經元的核周體，而并不破壞通過此區域的神經纖維，因此損毀的選擇性較好，動物有記憶力功能障礙，但并不出現SP和NFT病理改變[12，13]。

二十世紀七十年代末到八十年代初，隨著其他神經遞質缺失相繼在AD腦組織中被發現和確定，AD發病機制變得越來越清楚，它不同于帕金森病，不是單一的神經 遞質退行性疾病，而是混合在一起的多種遞質系統退化所引起。人們的注意力逐漸集中到突觸功能障礙和核周質退化的機制，因為它們會影響到邊緣系和聯合皮質多 種類型的神經元。這種認識可以解釋為什么大多數服用膽堿酯酶抑制劑的病人，其遠期臨床療效并不理想。基于以上原因，本模型只復制了AD膽堿能功能減退的特 征，并未復制出其他遞質功能減退的表征，更沒有出現AD的典型病理改變——SP和NFT。

三、以AD發病的遺傳學為基礎的轉基因動物模型

（一）Aβ假說

自從Alzheimer于1906年首次報道進行性記憶和認知功能減退的AD患者以來，以發現者名字命名的該疾病一直困擾著人們。Alzheimer注意 到病人的大腦有NFT和血管外的SP病理改變，但不能區分這是致病因子或僅僅是疾病的標志物。直到20世紀末，隨著分子生物學方法及相關科學的進步，才使 人們加深了對AD的認識。1991年在基因相關分析研究中人們發現了重要的線索：β淀粉樣蛋白前體（Amyloid beta-protein precursor，APP）基因的錯義突變會導致常染色體顯性遺傳的家族性AD（FAD）的發生，這些突變發生在APP的Aβ編碼區[14]。隨后又發 現與AD發病有關的其他3個基因，分別是14號、1號和19號染色體上的早老素1（prsenilin-1，PS1）基因、早老素 2（prsenilin-2，PS2）基因和載脂蛋白E4（apolipoprotein E4，apoE4）基因[15，16，17]，它們的突變或多態型會使AD發病的危險性增加。APP、PS1和PS2基因主要與FAD有關，FAD病人至 少有其中之一的異常，大約10%的FAD和2%散發性AD存在APP基因突變，而PS基因突變的患者則高達40%～50%[17]。ApoE與FAD和散 發性AD都有關。與FAD相聯系的每一個基因改變以及從基因型到表型的改變的闡明使人們形成一個共識，即至少FAD的形成是這樣開始的。故而人們把研究目 光轉向了形成SP的主要成分Aβ上，經過一系列的研究之后，在其代謝的關鍵酶α、ß、γ分泌酶（secretase）的確立及其代謝的分子機制方面取得了 一些進展。這些新發現加上Aβ易于形成具有神經毒性的蛋白，導致大腦神經元功能障礙，出現AD相應臨床表現。一種疾病發生發展過程的粗略輪廓開始浮現，逐 漸形成了AD發病的Aβ假說，該學說認為各種病因最終作用的結果是引起Aβ代謝異常，表現為Aβ過度產生，降解減少，Aβ聚集或沉積，引發各種免疫炎癥反 應和神經毒性級聯反應，導致廣泛的神經元變性和細胞功能障礙、突觸缺失及因凋亡或死亡引起神經元減少等一系列的病理生理變化，最終導致AD發生。因 此，Aβ沉積是AD發病機制的始發因素和中心環節[18]，自然成為AD研究的主要方向和熱點，同時也為治療AD帶來了新的藥物作用靶點。

（二）轉基因和AD轉基因動物模型

人們發現AD以上基因突變的同時，便開始借助新出現的轉基因技術，將已發現的人類的4個突變的外源性基因轉入動物體內來制備轉基因動物模型，這已成為動物 模型制作中一個比較新的方法，該方法將FAD相關的人類突變基因轉入動物中，并使外源性基因穩定遺傳，改變動物遺傳學性狀，達到在動物體內模擬人類FAD 遺傳特征的目的，并以此來篩選針對Aβ靶點的AD治療藥物。

轉基因是將外源性基因引入基因組，并使外源性基因穩定遺傳的方法。在過去的15年間，外源性基因轉入哺乳動物基因組已成常規實驗操作方法。傳統的方法是將 目的基因通過顯微注射導入單細胞受精卵中，存活的受精卵移植到假孕動物的子宮內發育成個體。部分受精卵在尚未分裂時，外源性DNA已整合、進入動物染色體 組。由這種卵發育而成的動物，由于其外源性基因整合進了生殖細胞，因而能穩定地將外源性基因遺傳給子代。隨著胚胎干細胞（embryonic stem，ES）技術的出現，以及同源重組基因打靶策略的發展，研究者能探尋特定基因的功能，并且能弄清楚基因的精細改變對基因功能的影響以及在體內產生 的特定效應。這種新的有效轉基因技術是首先建立ES細胞系，從發育中的囊胚內細胞團中取出細胞，在滋養層上或有分化抑制活性的培養基上傳代以維持去分化狀 態，然后通過電擊、轉染、微注射等方法將外源性基因轉入ES細胞，細胞經篩選后再送入囊胚，囊胚移植入假孕雌性動物體內發育成個體。這樣出生的個體與傳統 的單細胞受精卵經顯微注射的個體相比，多為嵌合體，因為攜帶轉入基因的細胞只占整個囊胚的一部分。只要攜帶有外源性基因的細胞能發育成生殖系細胞，通過育 種就可以建立轉基因系。將外源性基因導入ES細胞要優于單細胞受精卵的顯微注射，因為可以設計外源DNA，使之與內源的同源序列發生同源重組。 Southern blot或PCR篩選后，可以鑒定出正確打靶的ES細胞克隆，經囊胚注射入宿主囊胚后發育成所要的嵌合體。

轉基因動物可在體內研究某一特定致病基因的作用，是研究AD獨特而重要的模型。轉基因動物分為兩類，第一類是含有無效基因的小鼠——基因敲除鼠 [19，.20]。它們通常用于了解敲除的基因在AD病因中的功能，與此同時它們可以再插入相關的人類突變型基因，以避免內源性小鼠基因可能的干擾作用。

第二類是AD轉基因小鼠表達AD突變的致病基因，從而表現出相關的AD表型的病理特征，通過對已存在的AD轉基因小鼠相雜交，附加額外的基因或因此來創造 轉雙基因或多基因的小鼠。這樣使得人們能對這些不同AD相關因素的相互作用進行研究[21，22]。基于遺傳背景、繁殖能力、操作難度和經濟等方面考慮， 目前的轉基因動物多選用小鼠。現有多種轉基因小鼠均可表達與AD病變有關的基因如APP、APP的C末端片段、tau、PS1、PS2、ApoE等。

1.制備Aβ沉積的轉基因小鼠所需要的參數

在構建一個轉基因小鼠時，啟動子的選擇對于決定其時間和空間的表達模式及基因的拷貝數起重要作用。小鼠轉APP和PS1基因的表達有15個不同的啟動子。 這些小鼠已成功的復制出AD的一些病理特征，如Aβ的過量產生和淀粉樣沉積。有些也通過轉基因啟動子產生并得到普遍應用，如APP啟動子[23]、朊病毒 蛋白啟動子[24]和PDGF-β[25]，均導致神經系統以外的一些表達，而Thy-1[26]啟動子則是神經元特異表達。啟動子的選擇同樣影響到成功 復制Aβ沉積建立轉基因小鼠所需要的一個參數——轉入基因的過度表達。早期的轉基因鼠系使用的是FAD的APP等位基因，但并沒有顯示出AD的任何病理特 征。這是由于轉入APP基因的過低水平，大概只有內源性鼠APP基因的1.3到1.4倍造成的[27]。

第二是鼠系的選擇問題，因為至少8個不同的鼠系被用來制作過度表達APP的轉基因小鼠[24，26]及表達PS基因（PS1和PS2）[28]。除了 APP和PS1轉基因鼠系產生于FVB/N株系[15，47，72]，所有的其它轉APP和PS1的小鼠都是建立在雜交鼠系上。雜交鼠能制造出更大的容積 并且有更強健的胚胎[29]。轉基因所用的鼠遺傳背景將對鼠系的維持和行為測試結果有明顯的影響。由于雜交鼠系攜帶有一些不良的特征，轉基因動物使用這些 鼠系時，將會帶有這些特征。這些不良特征包括FVB/N，CBA和C3H遺傳背景中的視力受損，DBA和129鼠背景中腫瘤的高發性，SJL雜交鼠系有一 更高水平的攻擊性和C57鼠出現年齡依賴耳聾[30]。另外，C57鼠顯示出年齡依賴的病理損害聚集，和淀粉樣沉積相似，但能與其分辨開來[31]。含有 這些損害特征的雜交鼠在依賴視覺系統的學習記憶測試中，如Morris水迷宮中會影響其成績。對于行為學測試包括學習記憶，最好的鼠系選擇卻是 C57B1/6J雜交鼠系。這個鼠系能較好適應Morris水迷宮、八臂迷宮和條件空間變換測試[29]。Carlson等[32]在研究小鼠的遺傳背景 對其表型的影響時，發現具有B6xSJL雜交遺傳背景能產生SP的Tg2576小鼠回交至C57B1/6J鼠時，每一個雜交的后代轉基因的傳遞和子孫的存 活率都降低了。C57B1/6J背景使轉APP基因小鼠的生存能力降低，其能力在Borchelt等培育的APPswe小鼠和C57B1/6J鼠系之間， 資料表明遺傳背景對存活狀態、行為及與APP過度表達相關的病理都有明顯的影響。

在成功復制Aβ沉積的轉基因小鼠模型建立以前，人們預測存在以下一些問題：轉入基因的異位表達，完全APP異構體缺乏和APPs-α下調的缺乏。為了解決 這些潛在的問題，酵母人工染色體技術(yeast artificial chromosome，YAC)被用于產生轉基因鼠系。Lamb等[33]通過導入編碼人類APP基因400-kbp DNA建立起轉基因小鼠，該類小鼠采用正確表達模式表達所有的APP剪切體亞型；第二個問題是，在小鼠中可能僅僅是復制出正常APP的水解和APPs-α 產量的減少。APPs-α已報道具有神經營養作用[35，36]和神經保護作用[37]。為了驗證這個假說，人們將含有瑞典突變Aβ的序列代替轉基因鼠系 中的Aβ序列 [38]。這個方法的優點是沒有增加APP的表達，其表達未超過正常水平并且沒產生外源性APP表達。與正常人類衰老的大腦相比，一個1.3到4.5月月 齡的這種轉基因小鼠大腦內的Aβ產量增加9倍。當APPswe突變存在時，估計這些小鼠的APPs-α產量可能減少。人們已在這些小鼠中觀察到，Aβ產生 增加和APPs-α分泌減少在神經元存活方面有潛在作用。進一步的證據表明，減少APPs-α分泌可能在成功復制AD小鼠模型中起作用。最近的一項研究表 明，在Swiss小鼠腦室內注射APPs-α能提高記憶能力[39]。因此，在將來的轉基因鼠研究中應當審慎地去監測Aβ增加和APPs-α減少的潛在神 經病理作用。

2．APP和PS轉基因小鼠

（1）Aβ沉積

早期發病的AD在整個AD病人中所占的比例較少，主要發生于30-60歲，通常帶有家族性。FAD中已發現了3個基因的突變能導致AD，即APP、PS1 和PS2基因。而轉基因小鼠過度表達FAD的APP、PS1和PS2等位基因能提高大腦Aβ水平。4種表達FAD突變型APP等位基因的轉基因鼠系已建 立，能產生SP，其具有雙折射特性及年齡依賴的特點[25，26，30，40 ]。第一個增加小鼠大腦Aβ水平的報道來自于轉人類APP695swe[24]和APP717V-F突變的PDAPP鼠。其APP水平為鼠內源APP的 2~3倍，有Aβ沉積的形成 [25]。用YAC技術和表達3倍于鼠APP水平的人類APPswe(R1.40)小鼠也顯示出總Aβ產量的提高和成比例增加的Aβ42（約占總量的 20%）[41]，與先前體外轉染APPswe細胞系的結果相似[42]。對PDAPP鼠進一步的分析[25]表明APP和APPs-β的區域水平在所有 年齡都是常量，而大腦一些區域中Aβ水平相對其它區域高，這些區域Aβ的沉積隨年齡增加而積累。與預期的結果相一致，APPV717I突變的PDAPP小 鼠產生的Aβ42為Aβ的主要種類[43]，而在含有APPV717I突變的AD病人皮質也有相似的結果報道[44]。國內目前也有此類轉基因動物模型， 秦川[45]等制作的過度表達APP695、751小鼠，與對照組相比，Aβ42免疫組化顯示大腦皮層、小鼠及海馬的神經細胞有Aβ沉積形成，剛果紅染色 可見大腦皮層及皮層間有淀粉樣物質形成。
對雜合子和純合子PDAPP小鼠幾個不同大腦區域APP水平的比較分析表明，純合子小鼠丘腦中全長APP的水平比雜合子鼠海馬中的要高。即使轉入的APP 基因是持續過度表達的，皮質和海馬中由單位全長APP產生的Aβ的水平是最高的。Aβ的沉積發生在這些區域，卻沒有發生在丘腦 [43]，表明轉基因小鼠大腦區域性因素使APP代謝產生Aβ和淀粉樣斑在這些區域的形成變得容易。與AD病人相似，小腦的病理損害是最輕的，直到疾病晚 期才開始發生。一個值得注意的例外是PS1E246A突變小鼠，其小腦病理改變在疾病相對早期的階段就能觀察到[46]。

過度表達PS1M146L或M146V基因小鼠大腦中的Aβ42的水平大約比表達PS1野生型（PS1WT）小鼠的Aβ42要高30%，而Aβ40水平卻 沒有顯著性差異。這些數據與含有PS1突變的FAD中觀察到的Aβ42水平增加的結果相吻合。轉PS2突變基因的小鼠大腦Aβ42水平也比轉PS2野生型 （PS2WT）的小鼠更高。然而，即使在研究中使用相同的夾心ELISA分析方法，在Oyama等研究中，轉PS2基因小鼠的Aβ水平并不與Duff等描 述的PS1轉基因小鼠相一致[47]。另一個不一致是在非轉基因的小鼠其Aβ的水平比PS2轉基因小鼠的更高一些[48] ，而過度表達突變型PS小鼠的大腦中并沒有出現任何的Aβ沉積，至少是在12月齡的時候。在轉PS1和PS2突變型基因小鼠中沒有出現關于Aβ沉積的報 道，這可能歸因于在這些小鼠中產生的Aβ或小鼠Aβ與人類Aβ在第3氨基酸殘基不同。有報道嚙齒類動物Aβ在體外不象人類Aβ那樣具有淀粉源性，并且轉基 因小鼠過多的制造鼠源Aβ顯示出與人類Aβ有共同免疫反應而當成彌散性沉積[49] 。

為檢測突變型PS1基因對轉基因鼠中人類APP代謝的影響，幾個研究小組建立雙轉基因小鼠。同時表達FAD PS1和APP基因的小鼠小鼠顯示出加速的淀粉樣沉積[50]。轉APPswe小鼠[24]和PS1M146L小鼠[47]雜交后產生的后代在13到16 周時，其皮質產生硫磺素S陽性Aβ沉積[43]。相似的，轉APPswe小鼠和PS1A246E小鼠雜交后產生加速的Aβ沉積，能在9個月齡時就能檢測到 [51]。PS1FAD的突變能夠增加Aβ42的產量[52] ，這些小鼠中加速的沉積的彌散斑主要是由Aβ42構成的，與這些斑為AD和Down’s綜合癥SP前身的假說相一致。另外觀察到轉Thy1-APPswe 小鼠——APP23，在彌散斑存在時就產生了具有剛果紅折光性的斑，這表明在小鼠身上從彌散斑到致密斑的成熟可能不是致密斑形成的先決條件[26]。這些 體內實驗結果證實突變型PS1能影響APP的代謝過程，與體外轉基因細胞試驗相一致。這些研究同樣也表明轉突變型PS和 APP雜交鼠提供了小鼠腦內形成Aβ沉積的最快途徑。

為考察減少的PS1WT對小鼠Aβ42/43水平的影響，PS1敲除小鼠與轉APPswe小鼠進行交配。1月和5月的后代大腦中的Aβ水平與PS1WT小 鼠相比沒有顯著性差異。這表明FAD相聯的PS1突變導致疾病的機制不能歸因于衰老過程中PS1WT的減少[53]。在另一個獨立研究中發現PS1無效基 因小鼠的Aβ40和Aβ42水平減少，表明AD病人中Aβ42的增加不是由于PS1的突變使PS1功能的喪失而引起的。在PS1敲除的無效背景中導入 Thy1-PS1A246E基因的小鼠同樣也進行了Aβ的測量，與Thy1-PS1 WT轉基因或非轉基因的對照相比，其Aβ42/ Aβ43的水平增加了[21]。

（2）Tau的改變

采用銀染的方法對轉APP和PS基因小鼠已存在的神經纖維進行分析，在過度表達PS1和APP的FAD等位基因小鼠中，沒有檢測到NFT。然而，在一些鼠 系出現了NFT的早期改變——tau的高度磷酸化。在Thy1-APPswe小鼠中，采用tau抗體對幾個磷酸化表位進行確認，發現扭曲的軸突含有高度磷 酸化tau[26]。NSE-APP751小鼠也有報道顯示出Alz50染色陽性[54]。

（3）營養障礙軸突、神經元損失和反應性膠質增生

在PrP-APPswe小鼠[24]中，用Gallyas銀染的方法發現斑的鄰近區域存在營養障礙軸突。PDAPP小鼠中使用抗突觸素的抗體觀察到的扭曲軸突與AD病人中的軸突改變相似，其營養障礙軸突具有密集的板狀體和神經絲的聚集，具有AD Ι型營養障礙軸突特征[25]。Sturchler-Pierrat[26]使用特定的方法也觀察到扭曲的軸突圍繞著Aβ沉積的核心，發現局部有一個扭曲的AchE陽性纖維，而目前已知AD病人中膽堿能神經元是嚴重受損的。

突觸的損失和神經元的死亡是AD的典型特征。神經元的損失可發生在SP附近區域，這已在PDAPP717[25]和Thy1-APPswe[26]小鼠中 報道過。然而對18月齡PDAPP小鼠的立體測量學研究表明，其皮質，海馬或扣狀帶等有斑的區域沒有顯示出明顯的神經元損失；而突觸素、MAP-2、細胞 色素氧化酶-2和細胞色素氧化酶-4的水平沒有減少，而膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）水平卻明顯增加[55]。與之相似，9月和12月的PS1A246E轉基因小鼠其皮質和海馬的神經元的數量沒有明顯的減少 [51]。用相同的研究方法發現14到18月齡的APP23（Thy1-APPswe）轉基因小鼠，其CA1區的金字塔神經元有明顯的減少 （14-25%），與此區域斑的數量呈負相關。其新皮質區域神經元計數與斑的數量之間卻沒有相關性。將同樣的技術應用于AD病人大腦中得到了一個相似的結 論[56]。APP23小鼠和其它APP轉基因小鼠之間的區別是APP23有一個更高的致密斑數量（占到90%）。至今沒有報道表明PS1和APP雙轉基因小鼠中出現有神經元損失的病理改變。
反應性膠質增生已在一些小鼠模型中報道。在PrP-APP695swe小鼠 [24]、PDAPP小鼠[55]和YAC過度表達APPsweR1.40系轉基因小鼠（Lamb et al.NSc.1998）中報道過GFAP染色陽性的星形膠質細胞增生，用細胞形態學方法檢測到小膠質細胞增生以及軸突的異常改變。但僅是在那些含有很高 剛果紅折光性斑的小鼠中才檢測到炎性反應[26]。反應性膠質細胞增生并沒有在9月或12月齡的HuPS1A246E小鼠檢測到，推測是由于Aβ沉積缺乏 所致。在PS1-A246E/APPswe和PS1 M146L/APPswe雙轉基因小鼠中，使用抗GFAP的抗體能檢測到反應性星形膠質細胞包圍著Aβ沉積[51]。因此，反應性膠質增生似乎與Aβ沉積 相聯。

（4）記憶力障礙

在小鼠的行為學研究中，Morris 水迷宮經常被用來檢測空間參考記憶；Y迷宮去檢測空間近期記憶；而放射狀迷宮用來檢測空間工作記憶。采用這些測試方法，在APP轉基因小鼠上發現學習和記 憶障礙。Tg2576小鼠在10月齡時，與對照的非轉基因小鼠相比，在Y迷宮和Morris水迷宮顯示出明顯成績下降。Tg2576小鼠回交到SJL背景 小鼠的后代12-15月齡時在Morris水迷宮測試中在出現記憶力障礙。這些小鼠的行為和其雙親Tg2576鼠相似[24] 。這表明年齡依賴的在行為學的改變不受小鼠遺傳背景影響。

從Tg2576與APPswe雜交獲得的雙轉基因小鼠[57]在3-3.5月齡時，在Y迷宮測試中成績明顯下降。這個雙轉基因的小鼠中發生的行為學障礙并 不比Tg2576 和APPswe小鼠發生得更早。Tg2576雙親鼠系3月齡的更早期分析表明，Y形迷宮測試中幾乎有確定的數值改變，但數據卻沒有統計學差異，這可能是由 于研究的老鼠數量偏少的原因[24]。這表明Tg2576小鼠在Y迷宮的出現的行為學改變既不是年齡依賴性的，也不因PS1M146L基因突變的存在而加 速。NSE-APP751小鼠同樣在水迷宮測試中表現出空間學習障礙。其行為學障礙在6-12月齡時變得明顯起來[58]。這表明認知的損害是由于APP 的過度表達引起的，而此時還沒有淀粉樣沉積的出現。與此相似，PrP-APPswe鼠回交到C57B6/L背景中制造出的小鼠用Morris水迷宮檢測， 其行為學障礙發生于12月齡，與對照組相比具有更長的逃避潛伏期[59]，而這些行為學障礙的小鼠卻缺乏Aβ沉積。這些小鼠產生最早的Aβ沉積部位是在齒 狀回分子層外部，與AD病人大腦SP經常發生在齒狀回分子層外部相似。綜上所述，轉基因小鼠在Morris水迷宮和Y迷宮所表現出認知功能的下降開始于任 何分子層偵測到淀粉樣沉積以前。需要進一步確定的是，淀粉樣沉積是否進一步加重了小鼠在Y-迷宮中的行為學損害。

3. Aβ和C100-4轉基因小鼠

轉基因小鼠也通過使用Aβ，100或104個氨基酸的APP片段來產生。C100是β分泌酶剪切APP的產物，能夠被γ分泌酶所水解而產生C端的Aβ。 FVB/N轉基因小鼠過度產生Aβ42，表現在整個皮質、齒狀回、丘腦和后腦的神經元都有Aβ的免疫反應[60]。和Hsiao APPswe FVB/N小鼠相似[52]，這些FVB/N小鼠表現出神經系統的異常和幼年的死亡，用TUNEL染色方法檢測到神經細胞凋亡和神經細胞發生的變性 [60]。推測可能是過多的Aβ42直接引起了神經元的變性和凋亡，導致這些小鼠身上所觀察到的神經學上的異常，但也可能是FVB/N遺傳背景產生的特殊 表現[32]。

三個研究小組產生了過度表達APP片段C100（或C104）的轉基因小鼠[61，62，63]。APP的C100區域含有APP的跨膜區域和α、β、γ 分泌酶的酶切位點。有一個是與信號肽設計在一起，以確保C100片段進入細胞的膜內室，在那里與分泌酶發生作用。C100的表達在啟動子的控制下制造出年 齡依賴的神經變性和海馬齒狀回區域的突觸損失。表達C104的B6C3鼠使用的是神經絲輕鏈啟動子，大腦結構中檢測到年齡依賴的Aβ聚集的免疫反應。然 而，在免疫雜交和免疫沉淀中卻沒有檢測到4kD的Aβ蛋白。這些小鼠海馬CA1區表現出年齡依賴星形膠質、小膠質增生反應和神經元損失。其在Morris 水迷宮中出現了空間學習障礙以及減少的長時程增強（LTP），而長時程抑制（LTD）卻沒有變化[62]。以上結果中產生出這樣的問題，究竟APP哪一方 面的代謝產生神經變性和認知障礙？一些轉基因小鼠發展成行為學障礙而沒有Aβ沉積的形成，這表明神經元功能障礙起源于APP的水解及運輸與Aβ的產量有關 聯，但卻不依賴于Aβ的產量。相反，在含有一個信號肽轉基因的C100小鼠，Aβ的產量能在C57BL/6×DBA鼠中檢測到[63]。該鼠到9月齡時沒 有產生明顯的淀粉樣沉積，也沒AchE活性的下降。在這些小鼠中，Aβ的沉積是否呈現年齡依賴的模式將是一個值得深入研究的問題。

4.載脂蛋白E小鼠

ApoE4是與AD相關聯的危險因素。ApoE4對含有APP突變的FAD有促進作用，但對具有PS突變的FAD卻沒有作用[64]。ApoE4與AD的 發病相聯不僅在病例對照研究所支持[65]，而且家族性AD為基礎相關研究中得到支持[66]。.現在認為，晚期發病的AD形式（發生于65歲以后）更為 普遍，這類AD病人的發病主要是與ApoE4有關，認為其參與了β淀粉樣斑的形成。含有ApoE4表型的AD病人大腦中Aβ40和Aβ42免疫反應斑的水 平都比不含有ApoE4表型的AD病人的水平要高[32] 。

缺乏ApoE的小鼠與PDAPP小鼠雜交的后代表現出Aβ沉積顯著的減少[67]。純合子的PDAPP+/+ApoE+/+的小鼠6月齡時，海馬與新皮質 出現了許多Aβ沉積，而PDAPP-/-ApoE-/-小鼠僅出現稀少的Aβ免疫反應。與PDAPP+/+和ApoE+/+鼠相比，PDAPP+/+ ApoE-/-小鼠的發生的沉積都是彌散斑。這個結果不能歸因于改變的APP蛋白水平和APP代謝產生的Aβ，因為在2月齡時，兩組的APP與Aβ水平沒 有差別[67]。雖然它的分子機制還不是很清楚，卻在淀粉樣假說和ApoE4危險因子之間建立了聯系。

ApoE敲除小鼠的記憶障礙和膽堿能神經元異常表明了ApoE和AD之間的另外一種聯系。攜帶有ApoE4等位基因的AD個體中，觀察到AchE神經元的 減少[37]。而缺乏ApoE的小鼠，通過生物化學和免疫組織學測量發現其海馬與皮質中的AchE活性下降，其在Morris水迷宮的工作記憶下降 [68]。這種在Morris水迷宮中的空間工作記憶障礙和膽堿能標記物的下降能夠被M1激動劑治療3周所逆轉[69]。然而，第二個ApoE敲除小鼠膽 堿能神經元研究發現，與配對的C57B1/6野生型小鼠相比，沒有明顯的膽堿能神經元數量和大小的減少及AchE活性的下降[70]。前一個研究中報道的 膽堿能缺陷可能是選擇小鼠的遺傳背景影響了膽堿能神經元生物特性 [71]。如果鼠系的精確遺傳背景與已知和合適對照小鼠相比，那么從一個遺傳背景到另一個遺傳背景的結果不相一致性，最終是能提供有用的信息，這需要不同 遺傳背景中確立一個遺傳背景作為標準通用的轉基因鼠系。人類遺傳疾病中個體不同外顯率可能是由于遺傳背景中突變的相互作用造成的，可能對于某些危險因子， 如ApoE4基因的作用特別明顯。ApoE-/-小鼠中的載脂蛋白基因敲除并替代成ApoE的異構體——ApoE3或ApoE4已表現出其在水迷宮測試中 出現的記憶力損害。在表達ApoE4的6月齡小鼠比對照小鼠或表達ApoE3小鼠，在水迷宮測試中在尋找隱藏平臺方面有一個更長的潛伏期[72]。

5．Tau基因小鼠

AD兩大病理改變除了SP外，另一個是NFT，其由高度磷酸化的微管相關蛋白tau構成的。正常的情況下，tau蛋白分布于軸突，結合微管和聚合的微管蛋 白，在軸突微管之間建立短的連接橋。AD病理條件下，tau被磷酸化重新分布于胞體和胞體樹突室，在那里聚集形成絲狀物（PHFs，pair helical filaments）。在疾病的晚期階段，這些絲充滿整個神經元胞體（NFT，neurofibrillary tangles）。SP和NFT能各自獨立的發生，由tau蛋白聚集形成的纖維纏結在一些情況下與那些普通神經變性疾病中的纖維纏結難以區別，但在這些普 通神經變性疾病中幾乎沒有發現含有Aβ沉積物和SP。相反的，Aβ的沉積物能在認知功能正常的老年人中發現，但卻沒有纖維纏結的發生。也有一些不常見的 AD病理是“纖維纏結稀少”的類型，即很少的NFT而有豐富的Aβ沉積斑。由磷酸化tau構成的NFT存在于一些不含SP的神經退行性疾病，如 Pick’s 病、漸進性核上性麻痹、皮質基底退行性疾病和17號染色體相聯帕金森綜合征額顳葉癡呆（frototemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP-17）。這些疾病的NFT分布不象AD只發生于神元內，還分布于膠質細胞中。到目前為止，在AD病人中并未發現在tau基因存在的異常改 變，而最近在FTDP-17中卻發現了具有致病的tau基因突變[73]。

（1）人類野生型tau基因小鼠

目前APP和PS轉基因模型小鼠不能形成tau絲，而當時與FTDP-17相聯的tau突變還未發現，幾個研究小組制作了人類野生型tau轉基因小鼠。第 一個tau小鼠模型[74]表達的是長的四倍（four-repeat，4R）tau同型體——htau40，采用的是人Thy1啟動子。使用全腦免疫雜 交的方法，發現人的tau基因的表達水平為內源性鼠Tau的10%。帶有人的tau標記的神經元能在大腦大部分區域觀察到，但它們的數量仍相對的少，只占 整個神經元的一小部分。和AD的一樣，轉基因鼠中人的tau存在于神經元胞體、軸突和樹突。其磷酸化位點包括Ser202/Thr205和Ser396 /Ser404，能被針對相應磷酸化位點的tau蛋白抗體AT8和PHF1所確認。轉基因鼠沒有觀察到tau蛋白絲的形成，而染色的tau為均質或粒狀 的，而不是纖維狀。另一個使用的是鼠3-羥基-甲基-戊二酰CoA還原酶啟動子的轉人最短tau同型體——htau44的小鼠也有相似的結果。總之，這些 人類野生型tau基因小鼠顯示出AD相聯紊亂疾病中NFT損害的早期改變，但卻不能產生NFT和缺乏明顯的神經病學癥狀。

（2）人類FTDP-17突變tau基因小鼠

目前已發現FTDP-17相聯的tau基因三個突變位點P301L、V337M和G272V[75]，將人類FTDP-17突變tau基因導入小鼠中，進 行表達制作轉基因小鼠。人類4Rtau基因同型體與突變型P301Ltau基因在鼠PrP啟動子控制下，在JNPL3鼠系中得到表達[76]。該小鼠到 10月齡大時，90%的小鼠產生了運動和行為學紊亂，出現延遲的翻正反應并且最終不能進入直立狀態。在懸掛實驗中，小鼠短暫抓住繩子后就掉下，而轉野生型 人tau的小鼠能用三個肢體和尾巴抓住保持不掉下。在出現癥狀兩周以內，衰退擴展到所有的肢體，JNPL3小鼠幾乎不能移動，出現張力障礙性體態。這些小 鼠體重減輕，梳理、發音和睜眼變得困難起來。而這些運動障礙使得這些小鼠不能在Morris游泳航行實驗中進行測試。腦干、端腦和間腦中出現膠質細胞增 生，脊髓有48%的運動神經元減少。通過剛果紅、Bielschowsky和Bodian銀染方法在腦干、間腦、小腦和脊髓確認有NFT的形成。

6.其它的可用于制備轉基因小鼠的基因 有報道其它的一些基因與AD的發病相關聯，但大部分卻是一個互相矛盾的數據。例如，有研究報道認為αI-抗凝乳蛋白酶與AD有關，而另外的研究卻反對 [77]。對于極低密度脂蛋白受體、丁酰膽堿脂酶]和低密度脂蛋白受體]病例對照研究的結果也是互相沖突[78]。如果這兩個與AD有關聯的基因能導入 HLA-A2等位基因，將會給我們提供有用的信息。雖然TGF-β1在遺傳學上與AD沒有什么聯系，但它在大腦損傷反應中扮演一個中心角色，小鼠大腦中的 星形膠質細胞增生反應時過度表達TGF-β1。hAPP和TGF-β1雙轉基因小鼠在2~3月時，大腦就出現了硫磺素S和Aβ免疫組化染色陽性，與大腦淀 粉樣血管病變相似。而僅表達hAPP對照小鼠在2~3月時卻沒有觀察到沉積，過度表達TGF-β1小鼠對hAPP的水平也沒有影響[79]。如果新的與 AD發病有關的基因被確立，將會復制出具備更精確AD病理和癥狀的轉基因動物。

轉基因動物模型腦內出現了AD特有的病理改變Aβ沉積和SP，而FTDP-17突變tau基因小鼠出現了tau的病理改變，特別是NFT的形成，在AD動 物模型方面取得了巨大的進步，為針對SP和NFT方面的新藥篩選提供了良好的動物模型。但建立轉基因動物模型需要復雜的技術和高昂的費用，這類模型缺乏一 個衰老過程，不能完全具備理想AD動物模型特征，鼠系的遺傳背景之間的差異導致同一類轉基因鼠出現差異，重復性較差。因此，轉基因模型要進一步推廣應用， 尤其是在新藥篩選和藥理毒理學研究方面將受到很大局限。

四、以AD發病的環境因素為基礎的動物模型

并不是所有的AD患者都具有陽性家族史，真正發生以上基因改變的患者所占的比例并不高，相當一部分患者從遺傳學上是找不到任何線索，因此外界環境危險因素 在AD發病中也占有重要的地位。目前人們已發現一些環境因素能引起AD患者發病率升高。大體上包括生物因素（如病毒感染、高血壓、糖尿病等）、物理因素 （如腦外傷等）和化學因素（如鋁元素含量過高）。目前只有鋁元素與AD發病的關系研究的比較多，并以此建立了鋁元素慢性中毒的AD動物模型。

研究發現AD患者腦組織中鋁含量增高，用原子吸收光譜儀測得鋁在健康人腦中是1.8±0.8mg·g-1(腦組織干重)，AD患者腦內鋁的含量是 3.6±2.9mg·g-1。而一般大于4mg·g-1即可引起神經細胞變性。游離鋁可以自由通過嗅神經和血腦屏障進入腦組織的，在嗅球中含量最高，鋁還 可以損害血管內皮細胞而破壞血腦屏障的完整性。鋁進入腦內取代Ca2+和Mg2+，同氨基酸鏈上的谷氨酸和精氨酸結合形成谷氨酸鋁鹽或精氨酸鋁鹽的穩定復 合物，在大腦皮質、海馬、杏仁核內富有谷氨酸神經元，鋁多沉積于這些部位。鋁在血液中可與轉鐵蛋白結合，在大腦皮質、海馬、室中隔和顳葉杏仁處存在著許多 轉鐵蛋白受體，故鋁易沉積于這些部位。動物實驗結果表明，無論是家兔或大鼠經靜脈、腹腔、皮下注射或是經胃腸道等途徑給予鋁化合物，均可見動物腦鋁含量明 顯增加，引起一系列行為異常，動物出現認知和記憶障礙的時間也早于其它指標。與幼年動物相比，鋁的行為毒性多見于成年和老年動物，年齡越大，對鋁的行為毒 性越敏感。鋁的毒性引起腦內神經原纖維變性形成纏結已有許多報道。Deboni等給家兔皮下注射乳酸鋁或酒石酸鋁30天以上，可見腦干、大腦皮層及海馬錐 體神經元中有NFT形成。其機制可能是鋁能抑制蛋白磷酸酯酶2A和2B的活性，從而促使異常磷酸化的tau蛋白產生，繼而導致NFT的形成。鋁中毒可影響 腦內的神經遞質的代謝，主要引起膽堿能神經元損傷，導致膽堿神經功能減退，引起學習記憶功能減退，對NE、5-HT、氨基酸及肽類等神經遞質系統也有影 響。鋁通過改變神經細胞的鈣穩態，提高脂質過氧化損害細胞的作用，造成細胞結構和功能障礙，引起細胞的損傷和凋亡。鋁引起腦內Aβ基因表達的增多也有報 道。錢亦華[80]等用AlCl3灌胃大鼠3個月建立老年性癡呆鼠模型，通過免疫組化的方法，發現其背海馬結構內各部分均可見較多Aβ樣免疫反應陽性神經 元，雖未有SP的形成，已說明鋁引起Aβ在神經元內產生增多。鋁引起Aβ在神經元內的沉積的機制可能與鋁元素引起APP過度表達，Aβ過多的產生及鋁元素 促進糖基與Aβ的定位連接有關。鑒于此，大多數學者認為鋁在AD發病中起主要的作用，能夠產生與AD相似的病理改變，形成鋁元素中毒學說。 Mclachlan等還觀察到三價金屬螯合劑能減緩AD的病程[81]。但也有不少意見不同的報道，認為鋁元素在AD發病中的并不是一個主要因素。而其它 的AD發病環境危險因素如何應用于動物模型，在動物身上研究其致病機理將是一個值得研究的課題。

五、多重復制AD模型

多重復制AD模型，是在現有模型的基礎上，利用綜合兩種或兩種以上模型方法獲得的一種復合模型。這類模型可以綜合獲得各種已有模型特點，符合AD的多因素 發病機制。目前已有的動物模型有，將Aβ(1～40或25～35)和小劑量的IBO共同注入大鼠海馬，2周后除出現神經元大量丟失外，注射點附近以及包括 CA1、CA2和部分腦回在內的腦區出現多數神經元異常。本實驗室采用D-半乳糖和AlCl3合并制備的AD模型呈現了整體衰老、學習記憶功能下降、膽堿 能系統功能減退、腦組織β-APP、PS1、BACE基因表達明顯增強，腦組織出現Aβ沉積并有類SP形成，成功地模擬了AD的發病及病理特征[82]。 在未發表的結果中，通過經典的Bieshowky銀染的方法證實海馬和大腦皮質神經纖維數量較正常對照組明顯減少，排列紊亂和NFT形成。該方法造模簡 單，造價低廉，適合大規模藥物篩選。就現有的AD動物模型而言，由于沒有一個完全模擬AD特征的動物模型，單一模型只模擬AD部分病理改變，把各種制作單 一模型的方法加以組合來模擬AD復雜的病因，是制備AD模型一個比較實際而有效的方法。

六、其它模擬AD部分特征的動物模型

岡田酸(okadaic acid，OA)損害模型：OA可以選擇性抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A，引起大鼠腦內出現類似AD病理改變的雙螺旋絲(paired helical filament，PHF)樣的磷酸化tau蛋白和Aβ沉積[83]。

腦缺血癡呆動物模型：人腦的供氧系統對腦功能有著重要的保護作用，缺血缺氧首先影響的是腦的正常功能，此時極易出現智能障礙。通常老年動物腦血流量較成年動物減少20%以上，老年動物慢性腦缺血，可以產生類似AD的病理生理改變[84]。

β淀粉樣肽(Aβ)損害模型：Aβ具有神經營養和神經毒性雙重作用[85]。根據Hardy和Higgins 1992年在《Science》上提出的AD Aβ級聯反應假說，Aβ沉積導致SP、NTF形成、細胞死亡和血管病變，最終導致癡呆。

第三節 小結和展望

目前AD實驗動物模型的滯后在很大程度上制約了其治療藥物的篩選，還沒有一個理想的AD治療藥物篩選模型。隨著AD病因和發病機制知識的增加和更加完善的 AD動物模型的出現，我們將能夠篩選得到具有良好開發前景的AD治療藥物，使這些藥物經臨床前客觀評價后順利進入臨床試驗。已有的AD動物模型，總的來 說，包括非轉基因模型和轉基因模型兩大類。非轉基因模型中，大部分AD模型只針對疾病某一方面的因素來制作AD模型，種類比較多，表現有空間學習記憶功能 的衰退，大多只針對AD病理的某一方面，相比AD錯綜復雜的病理過程來說有一定的差距。更重要的是缺乏AD腦內特征性變化，即AD病理改變中的SP和 NFT。非轉基因模型的優點是其制備方法相對簡單，重復性和穩定性較好，適合大規模藥物篩選，其中多重復制AD模型能多更好的模擬出AD的多病因的綜合作 用，基本具備了AD的病理特征，將是一個較好的藥物篩選模型。

最近出現的轉基因動物模型是AD模型中的一個熱點，在小鼠中構建AD致病基因的轉基因動物在AD動物模型方面前進了一大步，轉基因小鼠在遺傳學上模擬了 AD的發病，出現了許多AD的病理學特征的改變，包括細胞外Aβ的沉積、SP和NFT等，部分轉基因小鼠還出現了炎性反應的改變。在這些小鼠模型中，Aβ 的濃度和Aβ沉積的大小能進行定量分析并且這些指標能反應出淀粉樣沉積的嚴重程度。大腦Aβ水平的免疫學分析能被用來監測化合物的效果，并能進一步分析其 作用機制，是干擾APP到Aβ的代謝還是阻止Aβ的變性。使用AD轉基因小鼠模型可以用于新藥發現的領域，單一轉基因小鼠通過雜交能產生轉多基因的小鼠， 這些小鼠與轉單基因的小鼠相比能較早的發展成Aβ沉積，可以加速實驗的進程。因此，轉基因小鼠對于評價一些針對Aβ和/或SP的產生、清除及對抗炎性反應 的藥物是有用的。AD的潛在候選藥物，如抗炎藥物和β、γ分泌酶抑制劑，而后者能抑制蛋白水解酶的活性而阻斷淀粉斑的形成從而減緩AD的發病進程。目前國 外已有β、γ分泌酶抑制劑的報道，由于γ分泌酶抑制劑只影響到Aβ產生對其他蛋白的代謝影響小，所以被認為是理想的作用靶點。γ分泌酶抑制劑按其核心結構 可分為為五類，分別為肽醛（peptide aldehydes）類、雙氟酮(difluoro ketones)類、甲基丙烯酸類似物（hydroxyethyl analogues）、氨磺酰葑胺（fenchy lamine sulfonamide）類和其他類。它們采用的大都是體外培養的轉APP基因細胞分析系統來檢測抑制劑對APP代謝的影響。本實驗室采用體外培養的轉染 有AD患者APP及突變型PS1基因的CHO細胞系（M146L），使之產生Aβ42，建立體外AD治療藥物篩選模型，通過篩選治療老年癡呆常用復方中使 用頻率較高的一些單味中藥及廣東習用藥材中的已知單體，初步發現廣東海風藤中的五味子乙素具有明顯抑制Aβ42產生的作用。表明五味子乙素很可能是一種潛 在的β和（或）γ分泌酶抑制劑，有可能成為治療AD很有前景的藥物，擬用轉基因動物模型和多重復制模型進行體內的藥效試驗。目前，分泌酶抑制劑這類藥物大 都尚處在動物實驗室階段，未見臨床報道。

最近采用轉基因動物作為AD模型的Aβ免疫治療法，在動物試驗上取得療效后，已進入臨床試驗。Schenk等[86]用Aβ42免疫PDAPP小鼠發現能 抑制小鼠大腦中β淀粉樣斑和相關的營養不良軸突的形成，緊接著小鼠Aβ42免疫法在幾個實驗室均取得成功。鑒于免疫治療在轉基因小鼠模型上取得的良好效 果，臨床試驗已經啟動。在這些研究中使用的抗原，即AN-1792（Elan制藥公司/Wyeth），是含有合成的Aβ42和佐劑（QS-21）的混合物。兩個I期臨床試驗已完成，它們評價了AN-1792對AD病人的安全性和耐 受性。第一個是使用三個逐級提高的單獨Aβ42劑量水平，佐劑的濃度是固定的。每一劑量組有8個病人，其提高劑量的間隔為6周。第二個I期臨床試驗是多劑 量（Aβ42和QS-21佐劑的劑量都在變）增加的研究，每個劑量水平之間的間隔為2~3月。

在這兩個研究中，AN-1792具有良好的耐受性，Ⅱa期臨床試驗已經在美國和歐洲開始。Ⅱa期臨床試驗招募到375個AD病人，在主動治療組 （n=300）已接受最高劑量Aβ42和最低劑量的在I期臨床使用的QS-21。然而，這個試驗由于出現了無菌性腦膜炎而被迫在2002年1月終止。所有 受影響的病人接受了1~3個劑量的AN-1792，并且他們的癥狀從最后一次接受藥物注射后一直持續了5天到5個月不等。盡管AN-1792的沒有繼續進 行，但剩下的病人沒有終止，并且這些病人將繼續被監控其安全、中樞神經系統變化、認知狀態和免疫功能1年。

這些副反應是沒有預料到的，在5個不同種類的動物包括靈長類上所做毒性實驗沒有揭示腦炎和任何其它的副反應，在Ⅱa期臨床試驗開始時，接受I期臨床實驗 64個病人中沒有一個產生了大腦炎癥的癥狀。Ⅱa期臨床試驗中的一些病人出現的這個反應明顯與免疫反應相聯系，盡管其潛在的機制還沒有找到。繼續進行的測 試正在調查Ⅱa期臨床試驗中一些病人身上出現的反應是否與免疫反應相關，例如T細胞介導的針對AN-1792的免疫反應。雖然AN-1792沒有繼續進行 下去，由于引人注目的臨床資料，人們還是在積極地追尋著安全、有效的免疫治療方法。幾個與AN-1792有很大不同的第二代免疫治療產品正在活躍地研制之 中。

盡管疾病的一些重要標志物，如Aβ沉積和SP已在AD小鼠中出現，轉基因小鼠也不能完全模擬出人類AD所觀察到的所有特征。現在仍有爭論是這些小鼠能否顯 示出AD其它的一些明顯而重要的特征，包括突觸數量的減少，神經元的死亡或損失。這是由于AD的進程中可能包括各種不同病理途徑的復雜的相互作用。APP 本身的過度表達產生的作用可能在轉基因鼠中是一個模糊的部分，因為在一些APP基因過度表達的小鼠中缺乏神經元損失的特征，其原因可能是由于增加的 APP，同樣導致潛在神經營養性APPs片段的增加。而產生的APPs-α，能阻止細胞的死亡。

即使已有的數據已表明鼠的大腦能重演AD的病理過程，但一些在AD轉基因小鼠上發生的生物學效應并不同于人類的AD，例如，基因流行病學研究表明 ApoE4是AD的一個危險因子，但是在表達人類ApoE亞型而不含鼠ApoE的轉基因鼠，早期Aβ沉積明顯下降。另一個缺陷的是NFT仍沒有在現有的 APP和PS轉基因鼠中找到，盡管小鼠體內異常的APP表達促進了tau蛋白的磷酸化，是NFT早期的改變。轉基因小鼠中NFT的缺乏及沒有神經元、突觸 的缺失和炎性反應，也不能正確地反映人類大腦中所發生的情況。因此，制備新的AD轉基因小鼠，如通過雜交使小鼠具備AD的各種各樣的突變基因以及其它的一 些癡呆如 FTDP-17正在被考慮之中。后者在tau基因上發現了突變，值得注意的是FTDP-17病人的大腦并不出現Aβ沉積，但表現出tau各種病理形式，包 括有主要的tau病理改變——NFT。大多數AD患者是散發性的，并沒有出現遺傳學上的基因突變，只有不到10%的AD患者具有家族性，而其中的多數也未 能發現基因突變，因此轉基因動物模型能模擬出AD發病的遺傳學因素，不能代表人類其它的AD發病類型，特別是晚期發病的AD形式。

開發有效治療AD化合物的前提條件是要有一個可靠的、能最大限度模擬AD的動物模型。遺傳學研究提供了確切的和假設的AD致病基因，使人們能設計和制備出 新的同時轉入多個基因的小鼠。將兩種轉基因動物進行雜交制備一種既有SP又有NFT的動物模型，或在轉基因動物的基礎上用藥物的方法加強或產生某一方面的 病理變化，這也是制備AD模型的一個方向。APP/PS突變小鼠與FTD突變tau小鼠雜交將產生一種具備兩大病理特征的模型，這種方法或許有良好的前 景。但需要將這些和/或其它基因同時構建到一個轉基因載體中，使轉入的每一個基因得到相等的表達。除了使用轉多基因的小鼠來加速和增加模型小鼠的病理改變 外，其它制備AD轉基因動物模型的策略是使用藥物或特殊的神經解剖損傷加重或削弱某個神經病理特征。或許將一些非轉基因模型中使用的干擾因素加入到轉基因 模型中，可能會改進轉基因動物模型。也許有必要在小鼠腦內模擬炎性反應（如對Aβ的炎性反應）而達到第二步的神經細胞死亡和反應性膠質增生的目的。另外基 因構建和鼠系的差異同樣也影響轉基因鼠的表型。轉同樣基因的小鼠，不同的鼠系影響其表型，很明顯鼠系的背景對于每一個在研的轉基因小鼠都應仔細研究。為了 解決不同APP轉基因鼠表型上的不一致，相關的一些實驗室需要進行更廣泛的合作。鼠系必須在同一標準的基因背景下，使用相同的分析方法，以建立標準的轉基 因動物模型。在更可靠、更準確的理想動物模型出現以前，就現有的AD動物模型而言，用兩種比較貼近AD的動物模型同時進行藥物篩選或許比用單一模型來篩選 藥物更有說服力，這樣能更快將藥物推向臨床。不同的單一模型雖只模擬部分病理改變，但可以根據模型發生的病理變化，針對不同作用靶點和機理進行藥物篩選。 另一種方法是把多種制作單一模型的方法合理相加來模擬AD復雜的病因，用這種多重復制的方法制作AD模型可能也是一個未來發展的方向。

另一個需要關注的問題是如何評價AD模型出現的行為學改變？怎樣反映在AD病人所觀察到的認知障礙？關于動物行為，其影響因素很復雜，而且易變，能被許多 不同的遺傳背景所影響，同時也受到環境因素所干擾]，因此，特別是采用不同鼠系制作的轉基因動物只有對各種各樣的變量盡可能提供足夠的對照，才能理解因素 之間復雜的相互作用。此外，需要進一步規范當前記憶測試系統，即“鼠化”人的行為學研究。例如，對現在老年人和AD病人所用的記憶測試方法應容易轉變為鼠 的測試方法，如迷宮用于測試空間記憶。但這些測試方法只限于空間記憶測試，對于人類這種具有語言的高級生物，使用的是第二信號系統，不僅僅是空間記憶的喪 失，還包括推理、抽象化和語言等方面能力的缺陷，而現有的迷宮記憶測試是無法模擬出AD諸多方面認知缺陷的，這需要人們尋找更有效的認知測試方法來最大限 度地檢測出AD動物模型的各種認知障礙。

總之，良好的AD動物模型最終將使AD的研究進入一個嶄新的時代，它將大大地加速AD治療藥物篩選的進程。由于人和動物之間存在著差異，即便某個AD動物 模型完全具備了人類AD的所有特征，通過該AD模型篩選到的“有效藥物”也未必對AD病人一定有效。最終還是要通過AD病人的臨床試驗予以確認，這才是最 有說服力的試驗，才能最終解決問題。