小麥是目前世界上種植最廣泛的糧食作物，全球至少三分之一的人口以小麥為主食。而小麥白粉病（powdery mildew）嚴重影響小麥的產量，小麥白粉病是由白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tri1ci，Bgt）引起的世界性真菌病害，培養小麥白粉病抗性品種是控制白粉病的有效途徑。

 

南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室的陳佩度教授是小麥遺傳育種的專家，他曾將簇毛麥（Haynaldia villosa）抗白粉病基因定位于6V染色體短臂，這一染色體區段后來被命名為Pm21。簇小麥-普通小麥易位系T6VS-6AL具有持久、廣譜的白粉病抗性，這也從一個側面證明了Pm21具有穩定的白粉病抗性功能。然而Pm21染色體區段上白粉病抗性基因的精細定位用傳統的分子遺傳方法卻很難實現，因為簇毛麥的6VS染色體區段與普通小麥的6AS不配對。

 

在本研究中，陳佩度教授領導研究小組利用基因芯片等技術手段，克隆并鑒定出Pm21基因簇的關鍵成員——絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶基因（Serine/threonine kinase gene，Stpk-V），此基因賦予了小麥白粉病抗性。該研究成果發表在2011年的PNAS雜志上。相關的基因芯片技術服務由上海伯豪生物技術有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心（）完成。

 

 

研究小組首先利用基因芯片（Affymetrix  Barley GeneChip）比較Bgt感染前后的簇毛麥表達譜，發現Bgt感染后，共有196個基因表達量增加了一倍，其中有131個基因具有明確的功能。在這131個基因中，研究人員發現了4個抗性相關基因（resistance gene analogues，RGAs），而其中只有一個基因位于簇毛麥的6VS區段，這個基因就是Stpk-V。隨后研究人員用RT-PCR的方法對基因芯片的結果進行了驗證，并用RACE的方法獲得了Stpk-V基因的cDNA全長，并用可轉化人工染色體（transforma Mon-competent arMficial chromosome，TAC）文庫的方法獲得了Stpk-V基因全長，Stpk-V基因共有6個外顯子和5個內含子。研究小組又用FISH和GISH的方法對Stpk-V進行基因組定位，證實它確實位于6VS的FL 0.45-0.58染色體區段上，這一區段正是Pm21基因簇的位置。

 

吸器（haustorium）是真菌生長過程中獲取營養物質的關鍵器官，吸器指數（haustorium index）也常被用來衡量真菌的生長狀況。研究小組利用瞬時表達的方法對Stpk-V對Bgt感染小麥的吸器指數進行了研究。

如圖所示。Yangmai158小麥是Bgt敏感型，易位系小麥T6VS-6AL則具有Bgt抗性。當Yangmai158瞬時表達對照基因GUS時，吸器指數高達54.8%；而Yangmai158瞬時表達GUS+Stpk-V時，吸器指數降低到13.6%。T6VS-6AL瞬時表達GUS，吸器指數為14.1%。這一結果表明，瞬時表達Stpk-V會抑制Bgt的生長。

 

Bgt感染T6VS-6AL和Yangmai158，隨后用RT-PCR分析Stpk-V的表達情況，發現Bgt的感染能增加T6VS-6AL中Stpk-V的表達量，而Yangmai158中則檢測不到Stpk-V的表達。用病毒誘導的基因沉默系統（virus-induced gene silencing system, VIGS）抑制簇毛麥和T6VS-6AL中的Stpk-V，會導致吸器指數的增加。

 

在Bgt感染T6VS-6AL易位系小麥后，可以觀察到明顯的因超敏反應（HypersensiMve Response，HR）引起的細胞死亡。植物的超敏反應是植物應對病原菌侵襲的一種保護性措施，主要表現是受侵細胞及其鄰近細胞的快速壞死，從而遏制病原菌的生長。研究人員推測Stpk-V對Bgt的抗性可能也是通過超敏反應實現的。

 

超敏反應最常見的信號分子是H2O2，于是研究人員開始研究三種小麥（Bgt敏感型Yangmai158，Bgt抗性型T6VS-6AL，轉化型pAHC：Stpk-V）在Bgt感染后H2O2的積累情況，并與生存情況對比。結果顯示，在Yangmai158中，H2O2僅在Bgt感染的初期大量富集，隨后含量降低，也沒有超敏反應的發生。而在T6VS-6AL和pAHC：Stpk-V中，H2O2始終存在，從而能引起超敏反應，遏制Bgt的進一步侵襲。

 

綜上所述，研究小組利用表達譜芯片的方法比較Bgt感染前后的簇毛麥表達譜，篩選到了位于Pm21基因簇上發揮Bgt抗性功能的基因Stpk-V，隨后利用吸器指數實驗和瞬時表達實驗證實Stpk-V確實能抑制Bgt的感染，最后通過比較三種不同基因型小麥在Bgt感染后H2O2的積累情況，發現Stpk-V對Bgt的抗性可能和植物的超敏反應有關。

 

 

 

Cao A, Xing L, Wang X, Yang X, Wang W, Sun Y, Qian C, Ni J, Chen Y, Liu D, Wang X, Chen P. From the Cover: Serine/threonine kinase gene Stpk-V, a key member of powdery mildew resistance gene Pm21, confers powdery mildew resistance in wheat. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108(19): 7727-7732.