細(xì)胞 PKG 激酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書（中文版）

主要用途

YIJI 細(xì)胞 PKG 激酶總活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)多肽底物受到 PKG 磷酸化后，進(jìn)而由

丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生 ADP 過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷

酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用比色法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中 PKG 總活性

的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃

取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或完全純化酶樣品中 PKG 激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。

產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

蛋白激酶G（protein kinase G；PKG；EC2.7.11.12），又稱為cGMP依賴性蛋白激酶（cGMP dependent protein

kinase；cGK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一，從單細(xì)胞生物草履

蟲（Paramecium）到人體高度進(jìn)化保留的激酶。哺乳動(dòng)物有2個(gè)亞型，I型和II型，其中I型有2個(gè)異構(gòu)體Iα

和Iβ。I型和II型結(jié)構(gòu)均為同源雙體，分別為75KD和85KD，其中包括調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域（cGMP結(jié)合位點(diǎn)）、催化

結(jié)構(gòu)域（磷酸化目標(biāo)蛋白）和N末端結(jié)構(gòu)域（底物結(jié)合）等。I型分布在細(xì)胞漿，而II型分布在質(zhì)膜上。I型

在平滑肌和血小板高度表達(dá)，而II型在腎、腸等組織細(xì)胞高度表達(dá)。PKG受到cGMP的作用，而被激活。其

功能在于調(diào)節(jié)平滑肌松弛、血小板功能、血壓、精子細(xì)胞代謝，細(xì)胞分裂，核酸合成，一氧化氮反應(yīng)等。

其磷酸化目標(biāo)序列為

。基于底物

，在ATP的存在下，受到PKG的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，

進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還

原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌

呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析蛋白激酶G

的總活性。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI 清理液（Reagent A）

YIJI 裂解液（Reagent B）

YIJI 緩沖液（Reagent C）

YIJI 酶促液（Reagent D）

YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

YIJI 底物液（Reagent F）

YIJI 陰性液（Reagent G）

產(chǎn)品說(shuō)明書

毫升

毫升

毫升

微升

微升

微升

微升

1份

保存方式

保存 YIJI 清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍

融；有效保證 6 月

1

用戶自備

PKG 激酶：用于抑制劑篩選

1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器

15 毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于細(xì)胞預(yù)處理

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好 25cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶或 60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1 至 5 X 106 細(xì)胞）

2． 小心加入

毫升 YIJI 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入

毫升 YIJI 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的 15 毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入

微升 YIJI 裂解液（Reagent B），充分混勻

10．轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

11．強(qiáng)力渦旋震蕩 15 秒

12．置于冰槽里孵育 30 分鐘

13．放進(jìn) 4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心 5 分鐘，速度為 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）

14．小心移取 500 微升上清液到新的預(yù)冷的 1.5 毫升離心管

15．移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

YJ30030.1）

16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為 30℃）：波長(zhǎng)為 340nm，間隔 1 分鐘，讀數(shù) 6 次（共 5 分鐘），并置零

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取

2． 加入

3． 加入

微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

微升 YIJI 陰性液（Reagent G）

4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘

2

5． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入

8． 加入

微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 5 分鐘

四、 樣品測(cè)定

1． 移取

2． 加入

微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

3． 加入 5 微升待測(cè)樣品（注意：50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解）

4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 2 分鐘

5． （選擇步驟）放進(jìn)分光光度儀，置零

6． （選擇步驟）取出比色皿

7． 加入

8． 加入

微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）

10．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)：340 波長(zhǎng)讀數(shù) 0 分鐘 －340 波長(zhǎng)讀數(shù) 5 分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

六、酶標(biāo)板測(cè)定

1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取

3． 分別加入

4． 分別加入

微升 YIJI 緩沖液（Reagent C）到 96 孔板中

微升 YIJI 酶促液（Reagent D）

微升 YIJI 陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50 微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)

孔中（注意：樣品須清澈）

5． 輕輕搖動(dòng) 96 孔酶標(biāo)板

6． 在 30℃溫度下孵育 2 分鐘

7． 分別加入

8． 分別加入

微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）

9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

10．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0 分鐘讀數(shù)和 5 分鐘讀數(shù)

11．活性計(jì)算：

單位＝微摩爾 NADH/分鐘

3

七、抑制劑篩選

1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、零抑制、完全抑制和待測(cè)抑制劑樣品

2． 按下表加入試劑

內(nèi)容物

樣本背景

零抑制對(duì)照

（0％抑制）

YIJI 緩沖液

（Reagent C）

YIJI 酶促液

（Reagent D）

待測(cè)抑制劑

用戶自備的純化酶

96 孔板每孔總量

（

微升

微升

背景孔

微升）

――

微升

零抑制孔

（

微升）

――

――

完全抑制孔

（

微升）

微升

微升

待測(cè)抑制劑樣品

（

微升）

微升

微升

微升

微升

微升

微升

完全抑制對(duì)照

（100％抑制）

微升

微升

待測(cè)抑制活性

3． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻

4． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 5 分鐘

5． 分別加入

6． 分別加入

微升 YIJI 反應(yīng)液（Reagent E）

微升 YIJI 底物液（Reagent F）（注意：除樣本背景孔外）

7． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

8． 放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里孵育 30 分鐘

9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)

10．獲得吸光讀數(shù)（OD）

11．抑制活性計(jì)算：

1）

2） IC50：50％抑制率所需的抑制劑濃度

3） 直接構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y 軸）為吸光讀數(shù) OD；橫座標(biāo)（X 軸）為已知抑制劑濃度

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為 25 次操作，包括背景操作

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需 1 次

4． 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要

6． 加入 YIJI 底物液（Reagent F）后 3 秒內(nèi)即刻比色測(cè)定

7． 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù) 30 分鐘

8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底

9． 樣本測(cè)定 0 分鐘讀數(shù)高于 5 分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10．建議待測(cè)樣本蛋白濃度為 50 微克/5 微升（本公司提供 YIJI Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－

YJ30030.1）

11．如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

4

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