GENMED細胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光譜法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

GENMED細胞CDK4/CYCLIN D激酶活性光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過人工合成多肽底物，在CDK6/CYCLIN D激酶抑制劑的存在下，受到CDK4/CYCLIN D磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，測定產生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應， 即采用光譜法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中CDK4/CYCLIN D特異活性的權威而經典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或完全純化酶樣品中CDK4/CYCLIN D激酶的特異活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

 

技術背景

 

細胞周期素依賴性激酶4（cyclin dependent kinase 4；CDK4；EC 2.7.11.22），又稱為皮膚惡性黑色素瘤因子3（cutaneous malignant melanoma 3；CMM3），屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬成員之一。其與酵母細胞的cdc28和cdc2高度進化保留。細胞周期素依賴性激酶4的催化亞體，在細胞周期素D和p16的調節(jié)下，在細胞周期G1-S期作用，允許細胞通過G1期，達到調節(jié)細胞生長、DNA復制、細胞分裂等。P16^INK4a 是CDK4激酶的抑制劑。成視網(wǎng)膜細胞瘤（retinoblastoma；Rb）基因產物是CDK4激酶的磷酸化目標蛋白。細胞周期素依賴性激酶4異常將導致惡性腫瘤等。CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化目標序列為RPPTLSPIPHIPR。基于底物RPPTLSPIPHIPR，在ATP和CDK6/CYCLIN D抑制劑Ro 318220的存在下，受到CDK4/CYCLIN D激酶的磷酸化，獲得產物磷酸化多肽，進而通過丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來定量分析細胞周期素依賴性激酶4/細胞周期素D的特異活性。其反應方式為：

 

產品內容

 

GENMED清理液（Reagent A）  毫升

GENMED裂解液（Reagent B）  毫升

GENMED緩沖液（Reagent C）  毫升

GENMED酶促液（Reagent D）  微升

GENMED反應液（Reagent E）  微升

GENMED底物液（Reagent F）  微升

GENMED陰性液（Reagent G）  微升

產品說明書     1份

 

保存方式

 

保存GENMED清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

CDK4/CYCLIN D激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

比色皿或酶標板：用于光譜分析操作的容器

分光光度儀或酶標儀：用于樣品光譜分析

 

實驗步驟

 

• 待測樣品準備

 

• 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

 

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如細胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零

 

• 背景對照測定

 

• 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升GENMED反應液（Reagent E）
• 加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

 

• 樣品測定

 

• 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升GENMED反應液（Reagent E）
• 加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
• 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測樣品（注意：50微克細胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內）
• 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)5分鐘

 

• 計算樣品活性

 

 

• 酶標板測定

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照和樣品
• 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板中
• 分別加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升GENMED反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升GENMED底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動96孔酶標板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升GENMED陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細胞裂解懸液蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動酶標板
• 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計算：

 

 

七、抑制劑篩選

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景、完全活性和待測抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進行樣品預處理

 

內容物	空背景對照	樣本背景	完全酶活性	待測抑制劑酶活性
GENMED緩沖液（Reagent C）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
GENMED陰性液（Reagent G）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	完全活性孔 （xx微升）	待測抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動酶標板，混勻，放進30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進行下列操作

 

• 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升GENMED酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升GENMED反應液（Reagent E）
• 分別加入xx微升GENMED底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動酶標板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預處理的待測樣品
• 即刻放進30℃酶標儀檢測：測讀30分鐘
• 抑制活性計算：

 

 

注意事項

 

• 本產品為25次操作，包括背景操作
• 操作時，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關重要 
• 加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定
• 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)30分鐘
• 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
• 樣本測定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供 GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 可以使用CDK4/CYCLIN D抑制劑二氨基氧吖啶氫硫酮【1,4-Dimethoxyacridine-9(10H)-thione）；IC50＝200納摩爾】或Arcyriaflavin A（IC50=59納摩爾）作為抑制劑對照或陰性對照
• CDK4/CYCLIN D激酶活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測試劑產品

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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