男性不育是全球范圍內日益受到重視的醫學與社會問題。據統計，約15%的育齡夫婦面臨生育困難，其中約50%與男性因素直接相關。男性不育的主要原因包括精子數量減少、活力下降、形態異常，以及精子功能缺陷等。盡管輔助生殖技術（如體外受精和卵胞漿內單精子注射）在一定程度上幫助了部分患者，但針對精子異常導致的胚胎發育問題，尤其是精子因素引發的早期胚胎停滯，仍缺乏明確的病因機制和有效治療策略。

近日，上海交通大學附屬第九人民醫院輔助生殖科蘆雪峰團隊首次報告了TDRD6基因突變是導致男性少弱畸形精子癥（OAT）及早期胚胎停滯的致病原因，深入探索了Tdrd6基因變異導致男性不育的機制，全面闡明了精子相關卵母細胞激活缺陷（OAD）影響2PN階段的基因表達，并揭示了輔助卵子激活（AOA）技術克服由男性因素引起的胚胎停滯的機制。這篇題為“Altered zygotic gene expression caused by sperm with Tdrd6 variants disrupts early embryonic development”的研究成果于2025年1月6日發表在《MedComm》雜志上。

圖片來源：《MedComm》
(https://doi.org/10.1002/mco2.70038)

研究材料與方法
在此項研究中，研究團隊通過二代測序技術對兩名男性不育患者進行了精準的分子診斷，發現他們是TDRD6基因變異患者。隨后通過構建Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型（由賽業生物提供），深入探索了Tdrd6基因變異導致男性不育的機制，利用適當劑量的AOA技術成功克服了由于Tdrd6基因變異引發的早期胚胎發育停滯問題，在小鼠模型中促成了成功妊娠和活產，且子代無明顯異常。在解析機制時，研究團隊采用了ICSI、AOA、MOAT、RNA-seq等方法。

技術路線
01 利用二代測序技術進行了精準的分子診斷，發現TDRD6基因變異男性不育患者
02 通過構建Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型，探索了該基因變異致男性不育的機制
03 利用AOA技術成功克服了由Tdrd6基因變異引發的早期胚胎發育停滯問題

研究結果
1. TDRD6基因突變是導致OAT及早期胚胎停滯的致病原因
根據全外顯子組測序（WES）分析，研究人員在2個OAT和ICSI治療早期胚胎停育的獨立家系中的2個不育男性個體中發現了TDRD6突變。家系1（Ⅱ-1）的患病個體攜帶純合移碼突變c.3026 - 3027delinsC（p.N1010Ifs*3），導致蛋白提前終止。家系2（Ⅱ- 1）中患病個體攜帶復合雜合變異c.A1256G（p.Y419C）和c.15501553delinsT（p.519del）。所有變異均經Sanger測序驗證（圖1）。
 

 
圖1：TDRD6基因突變是導致OAT及早期胚胎停滯的致病原因

為了進一步研究Tdrd6基因變異導致男性不育的機制，研究團隊利用了賽業生物提供的由CRISPR系統構建的Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型（圖2）。

圖2：TDRD6基因敲除小鼠的策略

睪丸和附睪的組織學分析顯示，小鼠模型的附睪中幾乎沒有精子，并且缺乏長形精子細胞，提示精子發生障礙。精子H&E染色和TEM分析發現小鼠模型的精子頭部形狀不規則，細胞核形態異常，細胞質殘留過多，頂體脫落，核周膜結構疏松(圖3)。
 

 
圖3：Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3} 和Tdrd6^−/−雄性小鼠精子頭部畸形和PLC-ζ分布異常

2. TDRD6突變導致PLC-ζ分布異常和卵母細胞激活缺陷
為了研究TDRD6變異患者精子的卵母細胞激活能力，研究人員進行了小鼠卵母細胞激活試驗（MOAT），結果顯示，2例TDRD6變異患者的2PN和2-細胞胚胎比例均顯著低于健康供者，反映了TDRD6變異患者精子的卵母細胞激活能力缺陷。注射TDRD6變異患者的精子后用2.5μM離子霉素激活小鼠卵母細胞，顯著提高了2PN率和2細胞率。

PLC-ζ是一種位于核周膜的關鍵精子傳播卵母細胞活化因子，可誘導Ca²⁺振蕩并啟動卵母細胞活。研究人員檢測了TDRD6突變患者精子中PLC-ζ 定位、PLC-ζ 表達和Ca²⁺ 振蕩模式。免疫熒光實驗顯示PLC-ζ位于正常獲能精子的頂體區域和頸部，TDRD6突變患者精子中的PLC-ζ 信號分布異常，僅定位于頸部，而不是頂體區域；免疫印跡實驗證實，TDRD6突變患者精子中的PLC-ζ 表達低于正常供體；鈣震蕩監測發現將正常供體的精子注射到小鼠卵母細胞后，30分鐘內出現了2次Ca²⁺峰值；使用TDRD6突變患者的精子時無峰值；在注射TDRD6突變患者的精子后，用2.5μM離子霉素激活小鼠卵母細胞導致Ca²⁺激增成功。這些發現表明TDRD6變異患者的精子在 PLC-ζ分布和表達方面存在缺陷，導致無法誘發Ca²⁺振蕩，從而導致卵母細胞活化失敗（圖4）。
 

圖4：TDRD6變異導致PLC-ζ分布異常且無法觸發Ca²⁺振蕩，ICSI-AOA提高了TDRD6變異患者精子的卵母細胞活化能力

3. 用適當的AOA可挽救ICSI中的Tdrd6 / TDRD6缺陷
在小鼠和人類中使用適當的AOA挽救ICSI中的Tdrd6/TDRD6缺陷作為一種化學卵母細胞激活劑，離子霉素被廣泛用于克服受精失敗，但其在克服早期胚胎停滯方面的有效性尚不清楚。因此，我們對Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠進行了不同工作濃度的離子霉素（1.0、2.5和10.0μM）的ICSI-AOA，以研究它是否可以改善受精和胚胎發育。令人驚訝的是，與非AOA 處理相比，用1.0、2.5和10.0μM離子霉素處理顯著提高了Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠精子的受精率。然而，只有含有2.5μM 離子霉素的 ICSI-AOA 成功克服了小鼠精子的早期胚胎停滯，并顯著提高了囊胚率。

為了進一步研究Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠是否能通過含有2.5μM 離子霉素的ICSI-AOA產生自己的后代，將雙細胞胚胎移植到假妊娠小鼠體內，結果發現胚胎成功植入并發育成正常的幼崽（圖5）。

圖5：2.5μM離子霉素克服了Tdrd6^{N1015Tfs*3/N1015Tfs*3}和Tdrd6^-/-小鼠的男性不育癥

4. Mos在受精卵中的異常表達會導致早期胚胎停滯
為了探究使用離子霉素進行AOA克服Tdrd6 ^{- / -}小鼠早期胚胎停育的機制，研究人員對WT組、Tdrd6 ^{- / -}組和Tdrd6 ^{- / -} ICSI - AOA組（2.5 μM離子霉素激活)的受精卵進行了RNA測序，通過對RNA測序數據的KEGG和GO分析，研究人員從中找到了鈣信號通路相關的Camkk2基因和胚胎發育相關的Mos基因（圖6）。

圖6：Camkk2或Mos的低水平表達可能是Tdrd6^-/-小鼠早期胚胎停滯的潛在機制

為了確認胚胎中Mos和Camkk2的表達水平，研究人員在用不同濃度離子霉素處理的WT受精卵和Tdrd6^−/−受精卵的不同胚胎發育階段進行了qRT-PCR，結果顯示，在 Tdrd6^−/−小鼠的PN4階段，Mos和Camkk2的表達水平確實很低，并且用2.5μM AOA處理挽救了Tdrd6^−/− PN4期胚胎中Mos和Camkk2的表達。因此，研究人員認為Camkk2或Mos的低水平表達可能是 Tdrd6^-/-小鼠早期胚胎停滯的潛在機制（圖7）。

隨后，研究人員通過Mos或Camkk2 mRNA顯微注射Tdrd6 ^{- / -} 小鼠PN4受精卵，并觀察隨后的胚胎發育，發現與對照組相比，用Camkk2 mRNA顯微注射的受精卵表現出更高的四細胞胚胎百分比，但胚胎沒有發育成囊胚。相比之下，Mos mRNA的顯微注射成功克服了早期胚胎停滯并顯著增加了囊胚率（圖6），表明Mos在Tdrd6 ^{- / -} 合子發育中起重要作用。
 

圖7：Tdrd6 ^{- / -} 精子受精引起Mos在受精卵中異常表達，從而導致早期胚胎停滯

研究結論
此研究通過構建Tdrd6基因敲入和敲除小鼠模型，探索了Tdrd6基因變異導致男性不育的機制，全面闡明了精子相關OAD影響2PN階段的基因表達，并揭示了AOA克服由男性因素引起的胚胎停滯的機制。