肝癌是全球范圍內一項重大的健康挑戰，其發病率正在不斷上升。肝細胞癌（HCC）是原發性肝癌中最常見的類型，約占所有肝癌病例的90%。HCC的治療面臨著復發率高、生存期短等難題，而現有的治療手段效果并不理想。因此，迫切需要深入研究驅動HCC進展的分子機制，以便發現新的診斷標志物和藥物靶點。

之前的研究發現，HCC中的膽固醇穩態受到嚴重破壞。NPC1（尼曼匹克病C型蛋白1）是一種與膽固醇轉運相關的蛋白質，在HCC中具有較高的預后風險評分。作為一種大的跨膜蛋白，NPC1主要定位在晚期內體/溶酶體膜上，被認為與膽固醇代謝和病毒感染（如埃博拉病毒）相關。不過，它在HCC中的確切作用仍不清楚。

近日，國家蛋白質科學中心（北京）姜穎課題組與賀福初院士團隊利用基因敲除（KO）小鼠模型闡明了NPC1在HCC發生和發展中的作用。他們發現，NPC1通過控制TGFBR1蛋白的穩定性來調控TGF-β通路，進而促進HCC進展，而這種機制與膽固醇轉運無關。這項成果發表在《Nature Communications》雜志上，提出了以NPC1為靶點的HCC治療策略。

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了多個小鼠模型來研究NPC1的作用，包括小鼠皮下腫瘤模型和尾靜脈轉移模型以及DEN/CCl₄誘導的HCC模型（Cre^AlbNpc1^F/F和Npc1^F/F小鼠由賽業生物提供）。他們還構建了他莫昔芬誘導的肝特異性Npc1基因敲除小鼠模型和MYC驅動的自發HCC小鼠模型。他們使用了過表達NPC1和穩定敲降NPC1的多個HCC細胞系，并開展了細胞增殖、遷移和侵襲分析。此外，他們還通過環己酰亞胺追蹤實驗和泛素化分析來檢測TGFBR1蛋白的穩定性。

技術路線

通過體外和體內實驗評估NPC1在HCC中的功能
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通過蛋白質組學等分析探索NPC1促進HCC進展的機制，以及是否與膽固醇轉運功能相關
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探索NPC1對TGFBR1蛋白穩定性的影響，以及NPC1通過何種機制影響TGFBR1蛋白的穩定性
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通過多個小鼠模型來驗證NPC1在調控TGF-β通路和HCC進展中的作用

研究結果
NPC1促進了HCC進展
研究人員首先分析了癌癥基因組圖譜（TCGA）數據集，發現在52%的癌癥類型（包括HCC）中，NPC1在腫瘤組織中顯著上調。與癌旁組織相比，NPC1在HCC組織中的蛋白和mRNA水平均顯著升高。NPC1高表達患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）明顯低于NPC1低表達患者。這些結果顯示，NPC1在HCC中發揮關鍵作用。

接下來，研究人員通過體外和體內實驗對NPC1在HCC中的功能進行了評估。他們使用了過表達NPC1的PLC/PRF/5細胞以及敲降NPC1的HepG2和MHCC-97H細胞。他們發現，NPC1過表達顯著增強了細胞的增殖、遷移和侵襲能力，而NPC1的沉默則顯著降低了這些能力。在回補NPC1后，這兩種細胞系的增殖、遷移和侵襲能力幾乎完全恢復。

為了進一步探討NPC1在腫瘤生長和轉移中的作用，他們采用了小鼠皮下腫瘤模型和尾靜脈轉移模型。在皮下瘤模型中，NPC1基因敲降導致腫瘤大小和重量顯著減少；在尾靜脈轉移模型中，NPC1基因敲降導致肺部腫瘤轉移顯著減少，進一步證明了它在腫瘤轉移中的關鍵作用。這些結果顯示，NPC1是促進HCC進展的關鍵因子。

NPC1以不依賴膽固醇轉運的方式調控TGF-β通路
為了探究NPC1促進HCC進展的機制，研究人員對敲降NPC1的PLC/PRF/5和HepG2細胞進行了蛋白質組學分析。通路富集分析表明，NPC1敲降顯著抑制了HCC細胞中的TGF-β通路激活，并導致TGFBR1、p-SMAD2和p-SMAD3蛋白水平下降（圖1）。從功能上講，敲降NPC1降低了HCC細胞的遷移能力（圖1）。這些結果表明，NPC1在促進HCC轉移的過程中主要調控了SMAD2/3的激活。

值得注意的是，在敲降NPC1后，回補NPC1的P691S突變體（膽固醇轉運活性缺失）仍能恢復TGFBR1和p-SMAD2的水平以及細胞遷移能力（圖1），表明NPC1調控TGF-β通路的方式與其膽固醇轉運功能無關。

圖1. NPC1以不依賴膽固醇轉運的方式調控TGF-β通路

NPC1增加TGFBR1蛋白的穩定性并抑制其泛素化
后續的環己酰亞胺追蹤實驗表明，NPC1在HCC細胞中的過表達延長了TGFBR1的半衰期，而NPC1的敲降則加速了TGFBR1的降解，強調NPC1在穩定TGFBR1蛋白水平中發揮作用。利用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，他們發現TGFBR1蛋白水平顯著增加，表明NPC1對TGFBR1降解的調控是由蛋白酶體介導的。此外，NPC1降低了Lys 48連接的多泛素化水平，而這種泛素化與蛋白酶體降解相關。這些數據表明，NPC1通過抑制Lys 48連接的泛素化，減少了TGFBR1的蛋白酶體降解，進而穩定了TGFBR1。

通過免疫共沉淀實驗和細胞共定位分析，研究人員證實了NPC1與TGFBR1存在相互作用，且TGFBR1-NPC1復合物主要存在于溶酶體中（圖2）。進一步分析表明，NPC1上的氨基酸692-854區域負責與TGFBR1結合。在穩定敲降NPC1的HCC細胞中，回補NPC1（P691S）可恢復TGFBR1表達和細胞遷移，但回補NPC1（Δ692-854）則無法挽救這些表型（圖2）。

他們推測NPC1可能通過調節TGFBR1與SMAD7或E3連接酶的相互作用來抑制其泛素化。后續實驗證實了這一點，NPC1過表達減少了TGFBR1與SMAD7及E3泛素酶SMURF1/2的相互作用（圖2）。這些結果表明，NPC1通過與TGFBR1相互作用并抑制其與SMAD7和SMURF1/2的結合，保護TGFBR1免受蛋白酶體降解。

圖2. NPC1與TGFBR1相互作用并抑制其與SMAD7/SMURF的結合

通過對286對人類HCC組織樣本的檢測，研究人員發現NPC1與TGFBR1的表達之間存在明顯的正相關。為了探索NPC1是否通過TGFBR1激活來促進HCC進展，他們利用TGFBR1抑制劑（LY2157299）來處理過表達NPC1的PLC/PRF/5細胞。這種處理可明顯減弱NPC1誘導的細胞遷移增強。此外，在小鼠尾靜脈轉移模型中，過表達TGFBR1挽救了NPC1敲降細胞的轉移潛力。這些結果表明，TGFBR1對NPC1介導的促進HCC進展至關重要。

肝臟NPC1缺失抑制TGF-β信號傳導并限制HCC進展
最后，研究人員還委托賽業生物構建了肝特異性的Npc1條件性基因敲除小鼠（Cre^AlbNpc1^F/F）和對照小鼠（Npc1^F/F），并通過DEN-CCl₄誘導了HCC模型。他們發現，在注射DEN 24周后，對照組小鼠出現了巨大的肝臟腫瘤，而Cre^AlbNpc1^F/F小鼠的腫瘤大小和數量均明顯下降（圖3）。在MYC驅動的自發HCC小鼠模型以及他莫昔芬誘導的Npc1基因敲除小鼠模型中，他們獲得了類似的結果。

染色結果顯示，Cre^AlbNpc1^F/F小鼠腫瘤中的侵襲性標志物減少。更重要的是，Npc1基因敲除導致TGFBR1及其下游效應物p-SMAD2的表達減少，這也印證了NPC1在調控TGF-β信號通路中的作用。同時，Cre^AlbNpc1^F/F小鼠的生存時間延長。這些結果有力地證明了NPC1在調控TGF-β通路和促進HCC進展中的作用，突出了NPC1的治療潛力。
 

圖3. 肝臟NPC1缺失抑制HCC腫瘤發生和進展

結論

圖4. NPC1調控TGF-β信號通路的示意圖

這項研究利用肝細胞中缺失Npc1的轉基因小鼠模型，確定了NPC1在肝細胞癌中的促腫瘤作用。NPC1與TGFBR1相互作用，阻礙其與SMAD7/SMURF復合物的結合，進而減少TGFBR1的泛素化。通過穩定TGFBR1蛋白，NPC1調控了TGF-β信號通路，并促進了癌癥的進展和轉移（圖3），而這與其在膽固醇轉運中的作用無關。這些結果不僅揭示了HCC進展背后的分子機制，也表明NPC1有望成為HCC的預后標志物和治療靶點。

原文檢索
Li, S., Yan, L., Li, C. et al. NPC1 controls TGFBR1 stability in a cholesterol transport-independent manner and promotes hepatocellular carcinoma progression. Nat Commun 16, 439 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-024-55788-5