背景

目前最廣泛使用于人類和牲畜疫苗的佐劑仍是鋁鹽佐劑。鋁佐劑化合物包括鋁鹽，如磷酸鋁AlPO₄和氫氧化鋁Al(OH)₃，在疫苗佐劑領域中一般稱做“明礬(鋁鹽)”。一般認為抗原必須吸附到佐劑的表面上從而提供充分的免疫原性。通常情況下明礬佐劑一方面充當免疫系統(tǒng)刺激物，同時另一方面作為抗原庫向給予(例如通過注射)的部位提供持續(xù)性的抗原釋放來刺激身體中抗體的產(chǎn)生。已知天然形式的鋁佐劑通常稱為凝膠，其為水性介質中的顆粒懸浮液。明礬-佐劑化疫苗的儲存和運輸是比較特殊的。凍干 (冷凍干燥)通常作為一種用于不同蛋白制劑的長期儲存的手段。然而,并不能在不對佐劑的結構造成破壞的情況下冷凍干燥含有鋁鹽佐劑的商用疫苗。冷凍干燥引起佐劑的凝膠結構的崩塌，導致再懸浮于水中時佐劑鹽的團聚和沉淀。一旦出現(xiàn)難以分散的硬沉淀，后果是顯著降低了疫苗的免疫原性即藥效性。

在一項關于明礬沉降行為的研究中，輝瑞發(fā)現(xiàn)，由于沉降過程是逐漸變化的，所以了解它們變化的參數(shù)并能夠測量出這些參數(shù)是很重要的。輝瑞隨后解釋說Turbiscan^®(法國Formulaction)提供了一種分析這些參數(shù)的新方法

介紹

諸如鋁鹽（明礬）等佐劑通常添加到疫苗中以增強其免疫反應。這些佐劑可以聚集，然后隨著時間的推移由于它們的電荷而沉淀。由此產(chǎn)生比較致密的硬沉淀，并且很難再分散。如果隨著儲存時間的推移這種現(xiàn)象不斷惡化，那么就會出現(xiàn)嚴重的問題，我們知道：

  • 注射劑量保持不變（當硬沉淀出現(xiàn)，聚集物較大且致密，所有活性成分并不會都能通過注射器針頭。）

  • 前面也提到免疫原性降低，治療效果也會降低。

在本文中，我們提出了一種鋁鹽疫苗再分散性能的快速評估新方法（少于30分鐘）

技術性

Turbiscan^®技術基于靜態(tài)多重光散射，發(fā)送光源（880 nm），并在樣品整個高度上獲取后向散射（BS）和傳輸（T）信號。通過在一段時間內(nèi)以合適的頻率重復此測量，儀器能夠監(jiān)測物理穩(wěn)定性。

常規(guī)方法：SVR（沉降體積比）

大昌華嘉公眾號之前的文章里面提到，傳統(tǒng)方法是通過SVR方法在24小時后確定疫苗沉淀量。SVR是沉降層高度與初始懸浮物高度的比值。SVR值越大（>0.1），懸浮性/再分散性越好，因為沉積物越不致密。這一比率可以通過Turbiscan的反向散射光檢測器獲得的數(shù)據(jù)中進行計算，如下圖所示。

為了防止免疫原性的喪失，溶液要控制絮凝（通過改變pH值或離子強度）。這可以讓疫苗形成松散絮狀物的弱粘結顆粒，并產(chǎn)生易于再分散的低密度沉積物（大量水被截留）。

新方法：Sonset（沉降開始時間）

盡管SVR方法非常可靠，但24小時對于質量控制或日常工作來說仍然太長。沉降開始時間（Sonset）似乎更方便，因為它的響應速度快（少于30分鐘）。Sonset方法是根據(jù)懸浮液由于沉淀作用上層溶液達到對應的澄清度（具體保密）的響應時間。

Sonset由傳輸信號確定，可由軟件一鍵計算并獲得。

Sonset方法的驗證：

為了驗證Sonset作為一種新的篩選方法，用不同pH值（3至9）的AlPO4懸浮液、離子強度（0至1000 mMmol NaCl）（含或不含模型抗原（BSA、溶菌酶））測定24小時SVR與Sonset之間的關系。

取20mL懸浮液并加入到Turbiscna專用樣品池中進行測量。每個數(shù)據(jù)集的收集時間為24小時。如上所述，分別從透射和反向散射數(shù)據(jù)中獲得每個樣品30分鐘后的沉降開始時間（Sonset）和24小時后的沉降體積比（SVR）。

而結果如下（圖3），2段絮凝水平的斜率曲線，可以用來判斷樣品系統(tǒng)是硬沉淀（陡坡）還是軟沉淀（緩坡）。

1.當懸浮液發(fā)生硬沉淀時（例如：低pH且無NaCl），AlPO₄仍然是分散顆粒（<3μm），導致沉降速度慢（Sonset>60min），從而防止溶劑在沉積物中滯留。它往往會壓縮成一個很硬的沉淀層，很難再分散。SVR值較低（<0.1）也是反映了這一點。

2. 當懸浮液發(fā)生軟沉淀時（中高pH值或/和高離子強度）中，絮凝體的松散結構很難保存在含有大量截留水的沉積物中。最終沉積物的體積相對較大反映為較大的SVR（>0.1）。沉積速率很高（Sonset<30分鐘），并且強烈依賴于絮凝水平（陡坡）。控制這些特性可以保證沉積物的良好再分散，并通過擴展其免疫原性。當Sonset值最低，藥效性也最強。

結論

Turbiscan有助于設計適當絮凝的明礬配方。通過改變配方pH值、離子強度和抗原數(shù)量，可以確定有利于絮凝系統(tǒng)的理想條件。使用上述沉降特性化方法（SVR和Sonset）有助于做出決定。Turbiscan分析的Sonset和SVR數(shù)據(jù)可以區(qū)分了AlPO₄配方的沉淀類型。最后，由于分析時間要短得多，Sonset值可以代替SVR數(shù)據(jù)作為表征懸浮液的再分散性能評價的參數(shù)的新方法），更適合配方篩選活動。

Turbiscan是一種強大的工具，可用于任何乳劑或分散體，在制藥工業(yè)中有多種應用，可用于配方開發(fā)過程、常規(guī)測試或質量控制中。我們的客戶可以全面和快速表征他們的配方穩(wěn)定性。Turbiscan的一次測量可以在30秒內(nèi)完成，使用Turbiscan測量穩(wěn)定性和進行貨架期研究比簡單的視覺分析快200倍。

沉淀現(xiàn)象的Turbiscan數(shù)據(jù)圖