外泌體作為活細胞釋放到細胞外基質中的膜性囊泡，攜帶蛋白質、核酸和脂類等多種生物活性分子，在細胞間進行物質交換和信息傳遞，在神經系統退行性疾病的發生、發展過程中具有重要作用。因此，外泌體在疾病的早期診斷和治療上具有重要研究價值。

        近年來，神經退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）的發病率和死亡率呈不斷升高的趨勢，它是一類起病隱匿的進展性疾病，其發病機制復雜，早期確診困難，因此尋找有效的生物標志物在ND患者的早期診斷、臨床治療和預后監測的過程中發揮著至關重要的作用。隨著對ND研究的不斷深入，發現大腦中所有細胞（包括神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞）分泌的外泌體，都在細胞通信中發揮關鍵作用，一方面，外泌體不僅在細胞內短距離傳播信號，而且通過血腦屏障廣泛傳播到整個大腦。另一方面，外泌體進行細胞間通訊時可以攜帶神經退行性疾病中病理性錯誤折疊蛋白，從而加快疾病的進展。

        現對外泌體的一般特性、外泌體與神經系統退行性疾病相互關系及其對于神經退行性疾病診斷和治療的應用價值進行概述。

一、外泌體概述

        1983年，Pan和Johnstone團隊首次在綿羊網織紅細胞成熟過程中，發現了一種與轉鐵蛋白釋放到細胞外途徑相關的小囊泡，并于1989年定義為外泌體（exosome）。最初，外泌體被認為是一種清除細胞代謝廢物的運輸工具，越來越多的研究表明，外泌體在細胞通訊過程中起重要作用，能夠反映并影響細胞的生理、病理狀態，其中某些分子成份與疾病的發生、發展、治療有密切聯系。

圖2     外泌體

1.1 外泌體的釋放

        細胞外囊泡根據其直徑大小可分為三種，分別為凋亡小體(50～5000 nm)、微泡(100～1000 nm)、外泌體(30～150 nm)。外泌體與細胞凋亡過程中產生的小囊泡不同，外泌體只能由活細胞分泌，且能被體內多種類型細胞分泌，廣泛存在于各種體液。外泌體通過胞吞-胞吐方式由親本細胞釋放；首先，胞膜內化形成胞內體，胞內體聚集形成多泡體(Mullivesicular Bodies, MVBs)，MVBs與親本細胞膜融合，通過胞吐作用將外泌體排出細胞。

圖3     外泌體的釋放與通訊

        在釋放到細胞外環境后，外泌體通過近分泌、旁分泌和內分泌等三種方式進行生物信息的交換和傳遞，在被受體細胞攝取后，其內載的DNA、mRNA、miRNA、蛋白質和脂質等組分通過改變轉錄和翻譯程序影響蛋白質的修飾和定位，調節信號級聯通路、關鍵酶反應等影響受體細胞的表型和功能。

1.2 外泌體的通訊作用

        外泌體與靶細胞交流通過以下方式：（1）外泌體膜與受體細胞膜相互融合，釋放所攜帶物質進入受體細胞。（2）通過配體受體之間相互作用激活信號通路。（3）細胞通過胞吞作用將整個外泌體內化后，與溶酶體融合，將所攜帶物質釋放入受體細胞。此外，內化后的外泌體還可以與MVBs融合，再次被分泌出細胞外。

1.3 外泌體的組成

        外泌體由構成性分子和運載分子共同組成，構成性分子取決于釋放外泌體的親本細胞種類，其外側雙層膜結構主要成分為脂質和蛋白質。外泌體的構成及運載分子包括RNA、脂質及蛋白質，其中蛋白質包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82 )、Flotillin、Alix、TSG101和熱休克蛋白(Hsc70、Hsp90)等，四次跨膜蛋白常被作為外泌體鑒定標志物。Flotillin主要用于膜蛋白之間的相互交流與信號轉導，研究表明FlotiUin可作為阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD )診斷的新型標志物。外泌體還攜帶有mRNA、miRNA、IncRNA、circRNA，并轉移至其它細胞中發揮生物學調控作用，成熟miRNA的一條單鏈可與某些蛋白質相互作用，形成RNA誘導沉默復合物(RISC)調節蛋白質表達。不同外泌體的運載分子不盡相同，這與外泌體親本細胞和外泌體形成過程中各種生理和病理條件有關。

圖4     外泌體的組成

二、外泌體與神經退行性疾病
2.1 外泌體與阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）

        AD的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉積形成神經炎性斑，及過度磷酸化Tau蛋白在神經元內形成神經原纖維纏結。AD患者的病理斑塊中有大量的Aβ及外泌體特定標志蛋白Alix存在，Rajendran等發現Aβ可通過外泌體分泌至細胞外，并證實了外泌體具有在細胞間傳播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力，當外泌體途徑被阻斷可減弱Aβ聚集和傳播。有研究報告：小膠質細胞減少可以抑制Tau蛋白增殖，小膠質細胞外泌體合成受到抑制，可降低Tau蛋白的繁殖與傳播，這說明小膠質細胞外泌體在AD的發生發展中同樣具有重要研究價值。另有研究發現：輕度至重度的AD患者，腦脊液外泌體中磷酸化Tau蛋白濃度顯著高于早期階段，這表明外泌體相關的磷酸化Tau蛋白與疾病的進展有關。
圖5      外泌體與阿爾茨海默病

2.2 外泌體與帕金森癥（Parkinson′s disease，PD）

        帕金森病（Parkinson′s disease，PD），也常被稱為“震顫麻痹”，是一種神經系統退行性疾病。這個疾病的主要原因是由于黑質多巴胺能神經元的退化和死亡，可能與遺傳、環境因素及神經系統老化等多種因素有關。PD 是僅次于 AD 的第二大類神經系統退行性疾病，65歲以上人群發病率為2% 。其病理特征是α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)構成的路易小體(Lewy Body，LB)在神經元胞體和軸突內沉積。目前認為神經元功能受損甚至死亡是由α-syn寡聚體引起的。

        α-syn是大腦中大量存在的一種可溶性蛋白質，尚不明確其健康狀態下的功能，但錯誤折疊和纖維狀聚集的α-syn沉積在中樞及周圍神經系統中將導致一系列α-突觸核蛋白病發生。

        α-syn可被分裝入外泌體釋放到細胞外環境，導致類似于朊病毒樣的病理傳播。實驗發現，PD患者血清外泌體中α-syn含量多于正常對照組，且α-syn以寡聚體形式存在于血清外泌體中；但PD患者腦脊液總α-syn含量低于正常對照組，可能是中樞神經系統由于某種保護機制向血液系統中轉運α-syn增加，其具體機制需進一步研究。將PD患者血清外泌體接種細胞，可致其表達α-syn單體及寡聚體增加；且用PD患者腦脊液外泌體接種健康小鼠，會使小鼠腦脊液中α-syn的表達水平呈劑量依賴型增加，故PD患者血清和腦脊液外泌體可以促進靶細胞中α-syn形成。依賴于完整的外泌體傳播途徑，與游離α-syn相比，外泌體中α-syn更容易被受體細胞內化，在神經系統傳播中，毒性更大。

        外泌體形成和分泌過程受自噬—溶酶體途徑(ALP)調節。ALP異常時，蛋白質清除能力下降，并影響PD及DLB的發生發展；ALP受損將導致細胞內α-syn寡聚體的清除效率降低，引起α-syn寡聚體向細胞外釋放增加，導致外泌體中α-syn寡聚體在細胞間傳播，加速疾病進展。

        小膠質細胞被認為是傳播α-syn寡聚體導致PD進展的潛在載體。用α-syn處理BV-2小鼠小膠質細胞，發現α-syn可以誘導小膠質細胞分泌外泌體增加，將此外泌體與神經元細胞共培養可致神經元細胞凋亡增多，說明外泌體在小膠質細胞介導PD的進展過程中扮演重要角色。

2.3  外泌體與多發性硬化（multiple sclerosis，MS）

        多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種病因未明的中樞神經系統炎性自身免疫性脫髓鞘疾病，主要累及腦、脊髓和視神經。其主要病理改變包括中樞神經系統白質脫髓鞘、炎性浸潤和軸突破壞等。

        外泌體在多發性硬化的發生發展過程中起到重要作用。其在體內外均可促進免疫炎癥因子的趨化和聚集。多發性硬化的特效藥物可降低腦脊液中外泌體的數量，提示外泌體可以作為多發性硬化的標志物之一。炎癥狀態下，外泌體的表達增加，增強細胞內、外炎癥介質（IL-1β、IL-6、COX2、iNOS等）的交換，炎癥因子的釋放，也促進免疫細胞的趨化，免疫細胞反過來增加含炎癥因子的外泌體的釋放，從正反兩相促進疾病進程。

        研究提示外泌體在MS的病理生理和發病過程中起著關鍵作用。在MS患者的血清和腦脊液中外泌體含量明顯升高，外周炎性細胞通過釋放含有γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)等炎性細胞因子的外泌體，進而損傷內皮細胞，破壞血腦屏障，介導MS發病。內皮細胞功能受損、血腦屏障通透性升高，進而使外周激活的淋巴細胞更易經損傷的BBB進入中樞神經系統，繼發脫髓鞘、軸突破壞等一系列典型病理損傷。另一方面，這些囊泡中表達的炎性細胞因子打破Th17和TregT細胞之間的平衡，促進疾病進展。

        MS至今尚無高度特異的生物學標記物。近年的研究表明，MS患者的血清和腦脊液中所含外泌體可以作為一種診斷標志物。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌體中含有50多種蛋白質，且有30種已被報道與MS的疾病進展有關。研究進一步發現，外泌體不僅可早期診斷MS，更可以區別MS亞型。在不同亞型的MS患者分離的外泌體含有不同的miRNA，揭示了外泌體的檢測可以作為一個更簡便更有效的診斷手段。

2.4 外泌體與其他退行性疾病

        肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種進展迅速的神經退行性疾病，以運動神經元丟失、隨意肌麻痹等為特征。在ALS患者的細胞外泌體中發現了錯誤折疊的蛋白質，如mSOD1、FUS、TDP43和C9orf72擴張DPRS等神經毒性成分。

        視神經脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是視神經與脊髓同時或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變。通過對NMO患者的腦脊液分離出的外泌體的蛋白組學分析發現，外泌體內含的NMO標志性蛋白（例如膠質細胞纖維原酸性蛋白GFAP）的表達有特異性的增加，結果與流式細胞術相一致。與此同時，MS、特發性縱橫肌炎（I-LETM）的特異性標志物也有相應表達。提示我們可以將腦脊液外泌體分析作為神經系統免疫疾病鑒別診斷的手段之一。

        這些研究和結果為外泌體診斷和治療神經退行性疾病提供了有力的證據，但還需要深入研究這類疾病的機制，并將這一知識轉化為臨床中的應用，從而為疾病治療帶來希望。

三、外泌體在神經系統退行性疾病的應用價值

        外泌體存在于各種體液中，便于獲得，其成分特異，所攜帶物質不僅能反映親本細胞的生理和病理狀態，并且外泌體可保護其攜帶的miRNA、蛋白質等穩定存在，不被核酸酶和蛋白酶降解，因此，可成為神經系統退行性疾病的診斷重要標志物；因其具有穿過血腦屏障的功能，對其進行修飾、裝載，將成為藥物治療的載體，可在神經系統退行性疾病的治療中發揮重要的作用。

3.1 外泌體與神經系統退行性疾病的診斷

        神經系統退行性疾病起病隱匿，早期無明顯臨床癥狀，但生物特性的變化已經在外泌體中體現，因此，外泌體的改變可為疾病早期診斷提供依據。目前PD的診斷多依賴于臨床癥狀，但當紋狀體中70%至80%和黑質中50%的多巴胺能神經元丟失時才出現運動癥狀，因此，PD早期診斷的生物學標志物有待進一步明確，人們正在嘗試從腦脊液、血液、尿液中提取外泌體及外泌體攜帶物質進行PD早期診斷的探索。

        與腦脊液相比，血液和尿液樣本更易獲得，但外周血中血小板和紅細胞會產生大量的α-syn，若制備樣本時發生溶血則影響血漿外泌體中α-syn檢測結果。在PD患者尿液外泌體中可檢測到與PD相關的LRRK2蛋白，但由于LRRK2在人體內表達多變，不能得到穩定的檢測結果，因此不能用于PD的早期診斷。DJ-1是一種由189個氨基酸構成的蛋白質，具有抑制α-syn聚集的作用，有研究發現男性PD患者尿液外泌體中DJ-1與正常人存在明顯差異，但研究樣本量較小，能否成為未來診斷標志物仍需進一步驗證。

        腦脊液可直接反映腦內病理變化，故使用腦脊液外泌體樣本對疾病診斷更精確，但不易獲得。對腦脊液外泌體miRNA分析發現PD患者腦脊液外泌體較正常對照組有16個miRNA表達上調，11個miRNA表達顯著下調，而miR-153、miR409-3p、miR-10a-5p顯著過度表達，這些差異有望成為PD早期診斷標志物。

         Aβ在腦內沉積是一個長期緩慢過程，對AD臨床前期診斷有助于早期干預疾病發生發展。研究表明AD患者血漿腦源性外泌體中總Tau蛋白、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ-142水平均顯著高于正常對照組，在認知正常的高危患者中可檢測到磷酸化Tau蛋白、P-S396-tau和P-T181-tau，這些改變可追溯到AD診斷的10年前。動態檢測發現，從臨床前的高危人群到AD確診，患者血漿外泌體Aβ1-42水平由逐漸升高到顯著增高，因此，血漿外泌體Aβ1-42具有刻畫AD進展的價值。

        外泌體的標志蛋白Flotillin是位于外泌體脂筏上的疏水性蛋白，可通過影響Ca²⁺穩態、線粒體功能參與AD的發病。一項臨床研究發現：與非AD人群相比，AD患者腦脊液和血清中Flotillin水平顯著下降，用正電子發射斷層攝影(PET)成像技術分析Aβ沉積，發現血清Flotillin水平與Aβ沉積負相關，這表明血清Flotillin 水平可用來評估Aβ沉積，可用于早期診斷。

3.2 外泌體與神經系統退行性疾病的治療

        外泌體經改造后可回輸至自體，減少因藥物載體帶來的免疫反應，提高治療的安全性，且由于其能夠通過血腦屏障，故可用外泌體作為藥物載體對神經系統退行性疾病進行靶向治療。中國研究團隊通過飽和溶液孵育法，成功有效的將多巴胺裝載入血漿外泌體中，通過動物實驗證實，裝載入血漿外泌體的多巴胺透過血腦屏障，被成功傳送至大腦的黑質和紋狀體，且多巴胺在腦內分布增加了15倍以上。有研究團隊將過氧化氫酶(強效抗氧化劑)在不改變外泌體結構的情況下裝載入外泌體，攜帶過氧化氫酶的外泌體透過血腦屏障，富集在神經元細胞和小膠質細胞，發揮強大的保護作用。上述的研究結果將為PD、AD及其他神經系統退行性疾病的治療提供新的方法。

四、小結

        隨著人口老齡化加劇，神經系統退行性疾病發病率越來越高，給患者、家庭及社會帶來巨大影響，探究其病理，對其進行早期診斷、早期干預成為當下解決問題的重點。

近年來學術領域對外泌體的結構和功能等的研究有了重大突破，已有多項研究證實外泌體在ND病理和治療過程中發揮關鍵作用，外泌體自身的優越性使其成為細胞間通訊的重要媒介，在調節正常生命活動和疾病的診斷和治療中能發揮獨特的生物學功能。作為當前的研究熱點，外泌體受到了國內外研究者的廣泛關注。對外泌體進行探索發現其與神經系統退行性疾病有巨大聯系，雖然目前僅在研究階段，實際應用還面臨諸多困難，但其仍不失為一種有前途的方法。

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