TSQ Endura LC-MS/MS與TraceFinder軟件用于440種農殘同時定量的高通量分析

瀏覽次數：3830　發布日期：2017-2-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

一站式流程化農殘檢測解決方案：TSQ Endura LC-MS/MS 與 TraceFinder 軟件用于蔬菜基質中 440 種農殘同時定量的高通量分析

1.前言

近些年來，此起彼伏的食品安全事件引起了人們強烈的關注，持續不斷地嚴格加強食品安全監管已經成為全社會最大的共識，這直接刺激了限量標準更嚴格、體系架構更嚴謹完備的食品安全標準的誕生與升級。在中國，新版GB2763-2014《食品中農藥最大殘留限量》國家標準已正式頒布實施，它連同日本的肯定列表制度（positive list system）、歐盟的EU/EC 指令條例No.752/2014 等一道，共同構成了各國嚴格的食品安全監管法規標準體系。相較于上一版，新國標2763-2014 收錄的農殘種類與最大殘留量指標（MRLs）都有了較大的擴容增項，這無疑對相應的農殘檢測手段提出了更高更嚴格的技術要求。時至今日，食品安全領域中的工作常態已然轉變為對復雜基質中數百計的多農殘項目同時進行高靈敏度、高特異性的高通量檢測，這種業態轉變需要質譜技術的革新，也需要測試解決方案的完善。

TSQ Endura LC-MS/MS是基于主動離子管控技術（Active Ion Management，AIMTM）開發的全新一代液質聯用系統，它通過S-lens射頻透鏡組、中性粒子擋桿、HyperQuad四極桿、主動離子碰撞池、雙模式離散打拿極檢測器等集成創新（圖1），使得儀器對離子聚焦、傳輸、隔離、碰撞與檢測等離子操控環節得以實現了全新突破，賦予了其領先的靈敏度、高達 500 SRM/s 的掃描速度與出色的穩健性，從而能全面滿足復雜基質中多農殘高通量檢測的各種技術挑戰，在食品安全領域中具有廣闊的應用空間與使用價值。

本文展示了一種以 TSQ Endura MS 為平臺、以 TraceFinderTM軟件為流程化驅動引擎的一站式農殘檢測解決方案，并將其用于菜椒基質中 440 種農殘同時定量的高通量檢測分析。

圖 1. 創新的 TSQ Endura MS 質譜儀硬件構造示意圖

1.實驗條件

2.1 樣品制備

實驗使用的農殘標樣由Ultra Scientific 公司提供（Rhode Island, USA），440 種農殘混標乙腈溶液的母液濃度為 2.5 µg/ mL。

菜椒（bell pepper）空白基質由美國California Department of Food and Agriculture 提供，基質由15 g 菜椒勻漿物使用15 mL 乙腈，經QuEChERS 方法提取獲得。配置基質加標樣時,先取適量基質加入1.5 倍體積超純水用以改善溶劑效應。再取農殘混標，使用乙腈/ 水（v/v, 4/6）逐級稀釋，最后將加水后的空白基質與對應濃度點的標樣溶液混合，充分渦旋混勻后，得濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5… ~200 pg/µL（ppb）的一系列溶液。由低至高，每個濃度點重復進樣三針，用以測試農殘在菜椒基質中的最低檢測限（LOD）與定量限（LOQ），每個農藥的標準曲線在LOQ 到 200 pg/µL濃度區間內繪制。

2.2 色譜分離

反相色譜分離使用Thermo Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀完成，配備HPG3400-RS 二元高壓梯度泵（35 µL 小體積靜態混合器）、WPS-3000TRS 自動進樣器與 TCC-3000RS柱溫箱,色譜條件見下表。

2.3 質譜檢測

質譜檢測使用TSQ Endura MS 串聯三重四極桿質譜儀的 tSRM 定時選擇反應監測功能（timed Selected Reaction Monitor）進行，配備Easy-Max NGTM HESI 加熱電噴霧離子源。包括保留時間、SRM 離子對、RF 電壓與碰撞能量等在內的 tSRM條件，直接從TraceFinder軟件pQuan化學數據庫（version 1.0, pesticides Quantitation chemical database）調用（圖 2）， TSQ Endura MS 儀器方法編輯為拖拽- 釋放式設計，且支持各種方法模板的靈活定制（圖 3）。根據農殘不同的電離屬性，方法中正負電離模式來回切換。依據不同化學屬性的農藥因色譜行為而造成的峰寬不同，設定 tSRM 時間窗口為 1~5 min。除十三嗎啉、丙環唑等少數物質外，其余絕大多數設定為 1 min。Q1 與 Q3 分辨率設定為0.7 FWHM，Q2 碰撞池氬氣壓力為 1.5 mTorr。tSRM 掃描循環時間（cycle time）為 1.2 s。其余質譜條件見下表。

圖 2 農殘檢測方法 TraceFinder pQuan 化學數據庫

圖 3 實驗使用的質譜 tSRM 儀器方法模板界面

2.4 數據處理

實驗使用TraceFinder 3.2 軟件進行數據庫管理、序列采集、數據處理以及報告模板自定義與輸出，其靈活強大的功能可為農殘檢測的流程化提供一站式服務。尤其，作為面向食品安全常見農殘的檢測方法數據庫，TraceFinder 中 pQuan 數據庫包含了完備的農殘定量與確證信息，以及保留時間、CAS、基本用途等其他相關信息（圖2）。利用pQuan 數據庫，實驗無需再使用標樣進行繁瑣的方法優化與開發，而是從數據庫中調取相關的條件，直接進行樣品測定。如圖 4 展示的步驟， TraceFinder 軟件使得同時進行數百種農殘檢測的繁復工作大大清晰地流程化了。

圖 4 TraceFinder 軟件用于農殘檢測的流程化工作步驟

3. 結果與討論 TSQ Endura MS 具有業界領先的 SRM 掃描速度，使用簡便的 tSRM 功能，質譜只在給定的時間窗口內進行特定離子對的掃描。一方面，這大大提高了質譜掃描離子駐留時間（dwell time）的利用率；另一方面，也唯有此才使得在短至20 min的快速梯度內同時對數百余種農殘進行高靈敏度檢測成為可能（圖 5）。通過對色譜條件的系統優化，從圖 6 散點圖與頻次圖可知，實驗實現了對440 種農殘良好的色譜分離，它們均勻地分布在 20 min 有效分離時間窗口內，這確保了質譜 tSRM 掃描循環時間可以較為均衡地分配到每個transition 上，改善定量效果。

圖 5 上圖：菜椒基質中 440 種農殘同時檢測的總離子流圖，下圖：440 種農殘的提取離子色譜圖（10 pg/µL）

圖 6（1）農殘精確m/z vs. 保留時間散點圖，（2）保留時間的頻次分布圖

TraceFinder 具有豐富強大的數據瀏覽、編輯與再處理等功能，能為高通量農殘檢測數據處理提供全方位的功能支持。圖 7 為 TraceFinder 數據結果的一種典型界面，這中間 LC-MS/MS 農殘分析的各種信息得以高度凝練地圖形化展示，統全局于一眼，大大有助于提高實際檢測工作中的信息處理效率。同時，這一界面可模板化編輯，具有出色的可擴展性，能滿足不同實驗室的個性化需求。

圖 7 TraceFinder 農殘檢測數據處理結果的典型界面（Compound View）

實驗嚴格綜合考慮峰面積的變異系數 CV % （LOD 濃度點處三次重復進樣的 CV% 開始穩定重現地小于 30%，LOQ 濃度點處小于 20%）、色譜峰形與信噪比等三種因素，確定了 TSQ Endura MS 對菜椒基質中 440 種農殘進行同時檢測的 LOD 與 LOQ 值，結果見表1。根據農藥化學屬性導致的響應水平不同，LOD在0.005 pg/µL（5 ppt）到 20 pg/µL（20 ppb）之間，LOQ分布在0.01 pg/µL（10 ppt）到 50 pg/µL（50 ppb）范圍內，對應的峰面積 CV% 分別為 0.34~29.95% 與 0.43~19.94%。并且，有 430 種農殘的標準曲線相關系數大于 0.99，顯示 TSQ Endura MS 具有出色的線性。

進一步的統計分析得知，實驗中 440 種農殘 LOD 與 LOQ 的中位數值（median value）分別為0.05 pg/µL（50 ppt）與 0.1 pg/µL（100 ppt），顯示了基于主動離子管控技術研發的 TSQ Endura MS 具有出色的靈敏度性能。同時，值得注意的是，本實驗為確保分析的高通量性與大多數農殘的檢測效果，使用了單一流動相體系進行快速正負電離切換，一定程度上犧牲了適用于負離子模式的農殘的檢測靈敏度（使用乙酸銨體系，會有很大改善）。但盡管如此，如圖 8 所示，對表 1 中的農殘 LOD 與 LOQ 值進行頻次分析可知，累計分別有438（占總數的 99.5%）與 430 種（占總數的 97.7%）農殘的 LOD 與 LOQ 小于 10 pg/µL 這一國標最低 MRL 限值，同時這也是歐盟法規與日本肯定列表制度中的通用標準。本方法實現的 LOQ 全部滿足GB2763-2014強制國家標準中的MRLs指標要求。因此， TSQ Endura LC-MS/MS 是食品安全領域中高靈敏度、高特異性與高通量農殘檢測的優質平臺。