張曉夕

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

目前，在對包括癌癥在內的各種疾病的診斷和治療中，單克隆抗體（mAbs）起到了越來越重要的作用，其相關研究發展也十分迅速。不同于傳統的小分子藥物，單克隆抗體的結構十分復雜，存在多種異構現象，故單克隆抗體結構表征就顯得尤為重要。由于生物質譜所具有的“軟電離”模式和高靈敏度、高質量精度和寬動態范圍等優點，在單克隆抗體分子量測定、蛋白序列測定、翻譯后修飾分析及雜質分析等方面，質譜正在起到越來越重要的作用。

 

離子阱質譜經常被用于未知物的結構解析，以及常規的蛋白序列測定、翻譯后修飾和糖鏈結構解析等。已有實驗結果表明，使用LTQ Velos 離子阱質譜可以對小的完整蛋白（16kDa）進行top down 解析[1]；然而，使用離子阱質譜對150kDa 的完整單克隆抗體進行完整分子量測定尚未見報道。

 

 

在本文的研究中我們使用Velos Pro 雙壓線性離子阱質譜，對完整單克隆抗體及其輕重鏈分別進行了分子量測定。實驗結果表明，離子阱質譜也能對150kDa 的完整單克隆抗體進行分子量測定，且不同糖型可得到分辨。

 

本次實驗使用完整單克隆抗體樣品，樣品濃度2μg/μL；取部分樣品上樣至常規液相色譜，經在線脫鹽后質譜測定其分子量；另取部分完整單克隆抗體樣品經二硫蘇糖醇（DTT）對二硫鍵還原烷基化后上樣至LC-MS 系統，分別測定輕、重鏈分子量。

 

色譜儀：Thermo Scientific Accela 600

色譜柱：Thermo BioBasic 8 HPLC（5μm, 2.1mm, 100mm）

上樣量：4μL（8μg）

流動相：A: 0.1% 甲酸水溶液，B: 0.1% 甲酸乙腈溶液梯度如下，其中前四分鐘為在線除鹽過程：

 

質譜儀：Velos Pro 線性離子阱質譜儀

噴霧電壓：3.8 kV

毛細管溫度：275 ℃

S-lens：66.8%

Scan Rate：Normal

m/z range：800-3500

In source CID：75eV

AGC target：3e5

 

數據使用ProMass 軟件進行去卷積分析。

 

 

 

圖1. LTQ Velos Pro 測定完整單克隆抗體分子量原始譜圖

 

 

圖2. 對圖1 譜圖進行去卷積

 

由圖1 及圖2 可以看出：首先，使用Velos pro 雙壓線性離子阱質譜對完整單克隆抗體（150kD）進行分子量測定，得到的譜圖中可見不同電荷態的峰均勻分布（圖1）；對其使用ProMass 軟件進行去卷積分析，可知所測單克隆抗體分子量為147491Da，且不同糖型得到分辨（圖2）。

 

使用DTT 對完整單克隆抗體進行還原處理后，分別對抗體的輕、重鏈進行分子量測定，結果如下：

 

 

圖3. LTQ Velos Pro 測定單克隆抗體輕鏈分子量

 

 

圖4. LTQ Velos Pro 測定單克隆抗體重鏈分子量

 

由圖3 及圖4 可以看出，對于DTT 處理后的單克隆抗體，分別測定其輕、重鏈分子量，同樣可得不同電荷態的峰均勻分布的譜圖；經去卷積后，分別可以得到輕、重鏈的分子量。其中重鏈部分的雜峰較多（圖4），可能為不同糖型及單抗發生降解所導致。

 

在本文的研究中，我們使用Velos Pro 雙壓線性離子阱對完整單克隆抗體及其輕重鏈進行了分子量測定。結果表明：首先，對于完整單克隆抗體，離子阱質譜可以實現分子量測定并分辨出不同糖型；對于經DTT 還原后的輕、重鏈，離子阱質譜同樣可以測定其分子量和不同糖型。離子阱質譜可滿足傳統定性分析需求，是未知化合物結構解析的強大武器；在蛋白質藥物研究方面，被廣泛用于肽圖分析、序列鑒定和翻譯后修飾研究等。通過本文的研究，我們證明了離子阱質譜同樣可以用于單克隆抗體分子量的測定。

 

同時，由于離子阱質譜可對化合物進行多級質譜解析，在肽段的翻譯后修飾研究、尤其是糖鏈的精細結構解析中起到不可或缺的作用。另外，雙壓線性離子阱Velos Pro同時具有高壓和低壓阱，高壓阱提供最大化離子捕獲、裂解和隔離效率，低壓阱提供其他離子阱質譜所無法比擬的分辨率和掃描速率。綜上，離子阱質譜亦為生物制藥行業相關分析的有力工具。

 

[1] Tonya Pekar Second, Joshua J. Coon, Vlad Zabrouskov. A Novel Dual-Pressure Linear Ion Trap Mass Spectrometer Improves the Analysis of Complex Protein Mixtures[J]. Anal Chem. 2009 September 15; 81(18): 7757–7765.