張偉 賽默飛世爾科技

譚青喬 中信國健藥業

 

糖基化修飾是生命活動中最廣泛、最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，不僅影響著蛋白質的空間構象、生物活性、運輸和定位，而且在分子識別、細胞通信、信號轉導等特定生物過程中發揮著至關重要的作用。糖蛋白根據其糖鏈結構及糖基化位點主要有N-糖蛋白與O-糖蛋白兩大類。據推斷，有超過50%的蛋白質都發生了糖基化修飾，但由于糖基化的高度復雜性，絕大多數糖蛋白尚未被發現，現有數據庫中只有約10%的蛋白質被注釋為糖蛋白[1]。首先，糖鏈的組成與結構非常復雜，糖鏈為非模板合成且呈二維結構，糖苷鍵連接位置和構象的不同都會形成差異的精細結構。據報道，僅僅由6 個不同單糖組成的寡糖鏈，其結構就可能達到驚人的1012種[2]。其次，當組成與結構各異的糖鏈連接在蛋白質上形成糖蛋白時，又構成微觀不均一性，即糖基化位點上糖鏈結構多樣化的問題，一個蛋白可能存在多個糖基化位點，而每個位點上又可能存在多種結構的糖鏈[3]。

 

隨著以單抗為代表的糖蛋白藥物的開發，質譜已廣泛應用于糖基化解析，通常先利用酶切或化學手段將糖鏈從糖蛋白釋放，再分別進行糖基化位點的鑒定和糖鏈結構的解析[4]。然而針對完整糖肽的解析，目前尚無成熟技術。本文利用新一代組合型質譜LTQ-Orbitrap Elite具有的HCD/ETD“雙碎裂模式”，解析一種復雜糖蛋白的完整糖肽，利用最新Byonic與SimGlycan軟件解析，成功發現2個N-糖基化位點，16個O-糖基化位點，83種位點特異性糖鏈組成與結構信息，在未脫糖狀態下使蛋白序列覆蓋度高達92.1%。

 

 

樣品為某種重組表達的高度糖基化蛋白，前處理使用二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酸（IAA）對二硫鍵還原烷基化，胰蛋白酶（Trypsin）酶解蛋白，最終濃度為1.5 μg/μL。

 

色譜柱：納流速C18 (2 μm, 100 A, 75 μm x 50 cm)，常規流速HILIC-NH2 (3 μm, 100 A, 2.0 mm x 15 cm)

色譜儀：C18柱使用納流速液相Easy-nLC 1000，HILIC-NH2柱使用常規流速液相Accela 600上樣量：2 μL

流動相：A: 0.1%甲酸水溶液，B: 0.1%甲酸乙腈溶液

梯度：C18: 3%-90% B, 120 min, 250 nL/min; HILIC-NH2: 95%-5% B,120 min, 200 μL/min

 

質譜儀：LTQ-Orbitrap Elite組合型高分辨質譜儀

離子源：

Easy-nLC 1000使用EASY-Spray納流電噴霧離子源：噴霧電壓2.3 kV，傳輸毛細管溫度：275°C，S-Lens：60%；

Accela 600使用HESI-II加熱電噴霧離子源：噴霧電壓3.5 kV，

鞘氣：30，輔助氣：10，傳輸毛細管溫度：275°C，SLens：60%

掃描方式：數據依賴性掃描：一級全掃描（分辨率60,000），Top15二級全掃描（分辨率15,000）；掃描范圍：母離子m/z 400-3500，子離子m/z 100-3500；動態排除：時間30s，排除范圍m/z -0.5~+1.5

碎裂模式：高能碰撞誘導解離HCD（NCE 35%），電子轉移解離ETD（100 ms for 2+）

 

數據使用Byonic軟件搜庫鑒定糖肽/非糖肽，具體參數為：酶：trypsin (KR)；專一性：全酶切；漏切位點：2；母離子質量精度：15 ppm；子離子質量精度：20 mD；固定修飾：C+58.005；可變修飾：M+15.995；糖基化修飾：N, O；肽段卡值標準：Score>150，Delta Mod>5，Log Probability<-1；糖基化位點卡值標準：Score>190，Delta Mod>10，Log Probability<-2。SEQUEST搜庫參數相同，卡值標準為5%FDR。糖肽糖鏈部分結構使用SimGlycan軟件解析。

 

 

實驗整體策略見圖1。本實驗采用nano-C18與氨基HILIC兩種分離方式分別對樣本進行色譜分離。C18是常用的蛋白/肽段分離色譜柱，而納流速的C18柱使被分析物的單位濃度顯著提高，靈敏度達到最佳，能夠有效分析低豐度/低離子化效率的肽段。氨基HILIC屬親水色譜，根據寡糖/聚糖組成和結構進行分離，是糖鏈結構解析、糖組學研究的有效工具。

 

同時，由于目標蛋白的糖基化高度復雜，本實驗同時采用HCD與ETD兩種碎裂模式進行質譜采集。HCD傾向于碎裂低電荷/低分子量的肽段，存在糖基化修飾時，優先碎裂單糖之間的糖苷鍵，同時高能碎裂能夠獲得更充分的碎片信息。ETD傾向于碎裂高電荷/高分子量的肽段，存在糖基化修飾時，優先碎裂肽段骨架的酰胺鍵。因此，HCD與ETD具有良好的互補性，兩者結合可以有效應用于完整糖肽的解析。

 

 

圖1. 糖肽解析流程圖

 

糖肽譜圖同時含有肽骨架與糖鏈的碎片信息，因此質譜數據的解析也是分析難點。Byonic是專業的糖肽解析軟件，采用創新的“Preview”算法和豐富的糖鏈組成數據庫，實現對肽段、糖基化位點的鑒定，并根據精確質量數給出糖鏈組成。SimGlycan是專業的糖鏈結構解析軟件，含有9650種糖鏈的理論碎片信息，是目前最大的商品化糖數據庫。本實驗先使用Byonic對數據進行序列鑒定，獲得糖基化位點與糖鏈的單糖組成信息，再使用SimGlycan對數據進行糖鏈結構解析，最終獲得糖肽序列、糖基化位點與位點特異的糖鏈結構。

 

 

圖2. 樣本LC-MS/MS總離子流圖（TIC）

 

圖2展示了樣本經nano-C18+HCD流程分析獲得的TIC圖，色譜峰分布均勻，達到理想分離效果，質譜響應達9次方。所有質譜數據經Byonic進行序列鑒定，蛋白序列覆蓋度達92.1%，而使用傳統算法SEQUEST進行搜庫，序列覆蓋度只有76.6%（圖3）。

 

 

圖3. (A) SEQUEST/Byonic序列鑒定覆蓋度對比；(B) Byonic對肽段二級譜圖匹配

 

SEQUEST算法無法鑒定完整糖肽，只能根據未發生糖基化的肽段分析序列，一些完全發生糖基化的肽段難以解析。相反，Byonic鑒定時根據其糖鏈數據庫，將糖基化作為可變修飾，因而能夠直接解析糖肽。因此，Byonic解析糖蛋白序列覆蓋度顯著提高。

 

在上述Byonic鑒定結果中，共包含28條糖肽，對應18個糖基化位點，其中，N-糖基化位點2個，O-糖基化位點16個；同時，共獲得位點特異的糖鏈組成83種，對應到每個位點最多17種，最少1種，平均每個位點5.2種。HCD與ETD兩種碎裂模式顯示出優異的互補性，使解析結果明顯增多（圖4）。

 

 

圖4. HCD/ETD碎裂獲得的糖肽解析結果比較

 

通過比較TKPREEQYNSTYR這條N-糖肽（N317）的質譜譜圖（圖5）可以看出，ETD與HCD都成功鑒定到這條糖肽，而ETD所獲得的碎片信息（c/z）更加豐富，位點同時被c、z離子覆蓋。相反，HCD所獲得的碎片信息（b/y）明顯減少，位點沒有被碎片離子覆蓋。但值得注意的是，HCD譜圖的高分子量端出現顯著的簇峰，峰之間相差162Da（Δm/z 81, 2+）或203 Da（Δm/z 101.5, 2+），表明糖肽的糖鏈部分發生碎裂。

 

 

圖5. 糖肽TKPREEQYNSTYR的HCD/ETD碎裂譜圖解析

 

ETD傾向于碎裂較強的肽骨架氨基酸之間的酰胺鍵，保留修飾基團，因此該糖肽在ETD中完整保留了糖鏈，獲得較為充分的肽骨架碎片（c/z系列），能夠更加有效鑒定肽段。HCD傾向于碎裂較弱的翻譯后修飾基團，造成該糖肽的糖鏈在HCD模式下發生顯著碎裂，呈現一系列相隔一個單糖的碎片峰，而肽骨架的碎裂被顯著抑制，b/y系列離子不充分且信號較弱；同時，帶有完整糖鏈的碎片難以產生，因此無法得到包含位點N的b/y碎片信息。

 

對于糖鏈較小的O-糖肽，HCD對糖鏈的影響沒有N-糖肽那么大，而且ETD碎裂的信號響應（103）明顯要弱于HCD（104），因此綜合而言，兩者鑒定到的糖肽和位點數量相當，展現了優異的互補性。

 

Byonic不考慮糖鏈碎片信息，只根據肽段碎片的精確分子量搜庫得到糖鏈的組成信息，本實驗進一步使用SimGlycan分析糖鏈具體結構。SimGlycan根據糖鏈碎片信息解析糖鏈結構，因此在解析具體結構的同時，也從另一方面對Byonic的鑒定結果進行了驗證，使最終結果更加可信。

 

 

圖6. 糖肽TKPREEQYNSTYR的HCD碎裂譜圖糖鏈解析

 

本實驗對所有鑒定到N317糖基化位點譜圖進行SimGlycan解析，最終75.6%的譜圖得到驗證，相應93.8%的糖鏈獲得結構信息。如表1所示，N317位點共有15種糖鏈結構，主要為高甘露糖型與雙鏈復雜型N-糖鏈，還包含了核心巖藻糖、唾液酸等重要結構。圖6進一步展示了圖5中HCD譜圖的糖鏈結構解析結果及部分碎片匹配圖，充分的糖鏈碎片離子信息表明Hex2HexNAc8的結構為三分支的高甘露糖型。

 

Byonic不考慮糖鏈碎片信息，只根據肽段碎片的精確分子量搜庫得到糖鏈的組成信息，本實驗進一步使用SimGlycan分析糖鏈具體結構。SimGlycan根據糖鏈碎片信息解析糖鏈結構，因此在解析具體結構的同時，也從另一方面對Byonic的鑒定結果進行了驗證，使最終結果更加可信。

 

表1. N317位點的糖鏈結構

 

 

另外，糖鏈存在諸多同分異構體，特別是組成一致，連接方式不同的精細結構差異，僅靠二級碎片難以區分。當然，LTQ-Orbitrap Elite所具有的多級解析能力（MSn），同樣能夠針對糖鏈實現有效的精細結構解析。

 

本文使用新一代組合型質譜LTQ-Orbitrap Elite，利用技術領先的HCD/ETD“雙碎裂模式”，結合先進的糖基化解析軟件Byonic與Simglycan，成功解析了一種高度糖基化蛋白的完整糖肽。實驗共獲得2個N-糖基化位點，16個O-糖基化位點，83種位點特異性糖鏈組成與結構，在未脫糖狀態下蛋白序列覆蓋度高達92.1%，最大化地實現了復雜糖蛋白的高效解析。技術領先的LTQ-Orbitrap Elite是糖組學、蛋白質組學、生物制藥領域復雜大分子解析的強大工具。

 

[1] Apweiler, R.; Hermjakob, H.; Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database [J]. Biochim. Biophys. Acta 1999, 1473 (1): 4-8.

[2] Morelle, W.; Canis, K.; Chirat, F.; Faid, V.; Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation [J]. Proteomics 2006, 6 (14): 3993-4015.

[3] 代景泉，蔡耘，錢小紅；蛋白質糖基化分析方法及其在蛋白質組學中的應用[J]. 生物技術通訊 2005, 16 (3): 287-292.

[4] Geyer, H.; Geyer, R. Strategies for analysis of glycoprotein glycosylation [J]. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1764 (12): 1853-1869.