聶愛英

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

LTQ-Orbitrap Elite；單抗藥物；分子質量分析；氨基酸序列分析；糖基化位點分析

 

單抗藥物主要是由兩條重鏈和兩條輕鏈通過鏈內和鏈間二硫鍵以及非共價鍵組成，分子質量大約在 150 kD 左右，每條重鏈和輕鏈在 N 端都包含一個可變區域，在 C 端都包含一個恒定區域，并且在每條重鏈上還存在一個 N 糖基化位點，該位點含有不同的糖鏈結構，如圖 1 所示。目前，在生物制藥領域中，單抗藥物以其高效的治療靶向性和特異性，越來越受到制藥公司和醫療單位的青睞。為了保證單抗藥物的有效性，以及單抗藥物生產過程的實時監控，對于單抗藥物的整體分子質量的測定、氨基酸序列的鑒定，糖基化位點的確認，二硫鍵的定位，糖鏈結構的解析等重要的分析技術，越來越受到制藥公司的關注。隨著生物質譜技術的不斷發展和推廣，基于生物質譜的單抗分析技術也開始全面、快速的開展起來。

 

目前，LTQ-Orbitrap Elite 組合式質譜儀結合了以前的雙壓線性離子阱質譜儀和新型高場 OrbitrapTM 質量分析器，提高了 MS和 MSn 的性能和多功能性。該系統具有高于 240,000 的分辨率（FWHM）、更高的靈敏度、高掃描速度和更大的動態范圍，同時結合了多種碎裂技術，為深度復雜樣品分析，包括蛋白質組學、代謝組學、脂類組學等樣品的鑒定，翻譯后修飾和定量分析，提供了全面、高效和快速的質譜分析平臺。

 

 

圖 1. 單抗藥物的簡單結構示意圖（V 表示可變區域，C 表示恒定區域，L 表示輕鏈，H 表示重鏈。）

 

2.1.1 儀器和試劑

質譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Accela 液相色譜系統（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：BioBasic 色譜柱（C8, 1×100 mm，5μm，300 Å）

（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸。

2.1.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 1；

質譜分析條件：具體見表 2；

2.1.3 數據分析方法

采用 Protein Deconvolution 2.0 軟件對原始質譜圖進行去卷積處理，得到完整的蛋白質分子質量信息。

 

表 1. 單抗分子質量測定的色譜分析條件

 

 

表 2. 單抗分子質量測定的質譜分析條件

 

 

2.2.1 儀器和試劑

質譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Easy-nLC 1000液相色譜系統（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Nano 色譜柱（C18，75μm × 150 mm，2 μm,100Å）（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，PNGaseF 內切糖苷酶，二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 內切蛋白酶。

 

2.2.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 3；

 

質譜分析條件：具體見表 4；

 

表 3. 氨基酸序列測定的色譜分析條件

表 4. 氨基酸序列測定的質譜分析條件

 

2.2.3 數據分析方法

采用 Proteome Discoverer 1.3 軟件對原始譜圖進行數據庫搜索，具體搜庫參數為：包含單抗氨基酸序列的數據庫；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設置為固定修飾；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）設置為可變修飾；trypsin 設置為酶；酶漏切位點為 2。設置肽段的置信水平為 99%，得到高置信的鑒定肽段和蛋白結果。

 

2.2.4 樣品前處理方法

將單抗樣品首先進行 PNGaseF 酶解，切除糖鏈后的蛋白質，再進行 DTT 還原和 IAA 烷基化，最后進行 trypsin 過夜酶解。

 

2.3.1 儀器和試劑

質譜儀器：LTQ-Orbitrap Elite（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Easy-nLC 1000 液相色譜系統（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Nano 色譜柱（C18，75 μm× 150 mm，2 μm,100Å）（賽默飛世爾科技，美國）；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），trypsin 內切蛋白酶。

 

2.3.2 儀器方法

色譜分析條件：具體見表 3；

質譜分析條件：具體見表 4；

 

2.3.3 數據分析方法

采用 Byonic 1.1 軟件對原始譜圖進行數據庫搜索，具體搜庫參數為：包含單抗氨基酸序列和 N 糖基化結構的數據庫；半胱氨酸（C）烷基化（+57.021Da）設置為固定修飾；甲硫氨酸（M）氧化（+15.995Da）和天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）脫氨基化（+0.984Da）設置為可變修飾；trypsin 設置為酶；酶漏切位點為 2。最終通過人工確認，得到準確的糖基化修飾肽段的鑒定信息。

 

基于高分辨質譜 LTQ-Orbitrap Elite，為了保證采集譜圖的質量和數量，我們設定高場 Orbitrap 檢測器的采集分辨率為15,000。

 

經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜采集的單抗原始質譜譜圖如圖 2-A所示，我們可以觀察到不同的電荷分布的質譜圖，選取強度最高的 m/z 為 2744.0384 的一組質譜峰為例，放大之后的質譜峰如圖 2-B 所示，可以看到質譜圖的靈敏度和信噪比都很高。

 

 

圖 2. LTQ-Orbitrap Elite 質譜采集的單抗原始質譜圖（A 為整體分布圖，B 為 m/z 為 2744.0384 的放大圖。）

 

經過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子質量分布圖（圖 3），根據單抗的氨基酸序列理論分子質量進行計算，將觀察到的質譜峰進行歸屬，可以初步推斷該單抗藥物存在多種形式的糖鏈結構，主要包括 G0、G0F、G1F 和 G2F，該結論與常見的單抗組成基本一致，同時根據質譜峰的峰強度信息，我們還可以計算得到不同糖型單抗的相對定量信息，如圖 3 中藍色數字所示。

 

圖 3. LTQ-Orbitrap Elite 質譜采集的單抗原始質譜圖經過 Protein Deconvolution 2.0 軟件去卷積處理之后的單抗分子質量分布圖（G0、G0F、G1F 和 G2F 表示不同類型的糖型，藍色數字表示質譜峰所對應的峰強度和相對定量信息。）

 

經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜數據采集和 Proteome Discoverer 1.3 軟件的數據庫搜索，以及肽段 99% 高置信水平卡值，在 trypsin酶解實驗中，單抗重鏈的蛋白序列覆蓋度為 97 %，如圖 4-A 所示，輕鏈的蛋白序列覆蓋度為 98 %，如圖 4-B 所示，由此證明LTQ-Orbitrap Elite 質譜可以準確、有效地實現單抗氨基酸序列的成功鑒定。其中未鑒定到的氨基酸序列主要是由于酶切后肽段過短不適合質譜鑒定所造成的，為了實現 100% 的氨基酸序列覆蓋，可以通過選擇其它內切蛋白酶來實現。

 

單抗蛋白中一般都包含 N-糖基化修飾，也就是說肽鏈的天冬酰胺（Asn，N） 殘基可以與糖鏈的還原端連接，形成不同糖鏈結構的糖基化蛋白，一般發生 N-糖基化修飾的位點都是在保守序列 NXS 或 NXT 中（X 為除脯氨酸外的任意氨基酸）。在經過內切糖苷酶 PNGase F酶切后，天冬酰胺（Asn，N）殘基會丟失糖鏈，產生 0.984 Da 的質量增加。不過在樣品處理過程中也可能會導致天冬酰胺、谷氨酰胺發生脫氨基化，同樣會使天冬酰胺產生 0.984 Da 的質量增加。最終的搜庫結果顯示一些天冬酰胺殘基存在0.984 Da 的質量增加，這可能是由于樣品發生了脫氨基化或者 N 糖鏈被酶解所致，進一步結合 N 糖基化位點的特定 NX(X≠P)S/T結構域信息，我們初步推斷該單抗中唯一可能發生糖基化的位點為：重鏈中氨基酸序列 EEQYNSTYR 中的 N 位點，為了得到準確的定性結果，我們進行了后續的糖基化位點鑒定實驗。

 

 

圖 4. 單抗經過 trypsin 酶解和 LTQ-Orbitrap Elite 質譜實現的氨基酸序列覆蓋度示意圖（A為重鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，B 為輕鏈氨基酸序列覆蓋示意圖，其中綠色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性非常高，達到 99% 以上，紅色標記的氨基酸序列表示該段序列鑒定的可靠性為 95% 以下，無顏色標記的氨基酸序列表示該段序列沒有被鑒定到，氨基酸序列上方的數字代表氨基酸的位置。）

 

經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜數據采集和 Byonic 1.1 軟件的數據庫搜索，共鑒定到 6 個糖基化修飾的肽段，分別對應于 G0（ ）、G0F（ ）和G1F（ ）（紅三角表示巖藻糖，藍方塊表示 N-乙酰氨基葡萄糖，綠圓表示甘露糖，黃圓表示半乳糖）等，每一條糖肽都經過人工確認，以其中的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽為例，如圖 5 所示，在二級質譜中，可以觀察到 6 個糖診斷離子（見表 5）和 8 個糖肽碎片離子（見表 6），同時結合 N 糖基化修飾位點的特定結構域信息，從而確證該肽段中天冬酰胺（N）殘基為 N-糖基化修飾位點。

 

由于采用了高分辨、高精度的 LTQ-Orbitrap Elite 質譜，糖診斷離子的質量偏差都在 1 ppm 以內，除了個別碎片離子外，基本所有的糖肽碎片離子的質量偏差也都在 1 ppm 以內，由此可以判斷該糖肽碎片離子的歸屬準確、可靠。

 

表 5. EEQYN（G0F）STYR 糖肽經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜鑒定到的糖診斷離子列表

 

表 6. EEQYN（G0F）STYR 糖肽經過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜鑒定到的糖肽碎片離子列表（紅三角表示巖藻糖；藍方塊表示N-乙酰氨基葡萄糖；綠圓表示甘露糖）

 

圖 5. LTQ-Orbitrap Elite 質譜采集的 EEQYN（G0F）STYR 糖肽的二級質譜圖（紅三角表示巖藻糖；藍方塊表示 N-乙酰氨基葡萄糖；綠圓表示甘露糖）

 

本文通過 LTQ-Orbitrap Elite 質譜建立了單抗藥物的整體分子質量測定、氨基酸序列鑒定和糖基化位點確認的分析方法，為常規單抗藥物研發分析和實時生產檢測提供了高效、快速的分析平臺。實驗結果表明 LTQ-Orbitrap Elite 組合式質譜儀，憑借其超高的分辨率，超快的掃描速度，超高的質量精度、超低的靈敏度和超大的動態范圍，極大地完善和推動了單抗藥物的鑒定分析。