從源頭到工藝：內毒素控制與去除全解析
內毒素（Endotoxin）是革蘭陰性菌外膜不可或缺的結構成分，是在細菌繁殖過程中以及菌體崩解、自溶時所釋放出的毒性物質，其主要成分為脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。
在生物制品的生產過程中，內毒素是常見且嚴重的污染源。內毒素污染不僅會影響生物制品的純度，還可能引發強烈的免疫反應，嚴重情況下甚至會導致患者出現發熱、休克等不良反應。因此，在生物制品的生產工藝中，內毒素的去除和檢測至關重要，是保障產品安全性的核心步驟。
Fig.1 內毒素結構示意圖（圖片引自Monteiro和Faciola，2020）
內毒素有單體、膠束或囊狀的存在形式。內毒素以膠束、立方體、層狀或囊泡形式聚集，在藥物溶液中呈現凈負電荷。帶負電荷的“膠束”內毒素可以吸附在多聚陽離子配體上，或者可以通過疏水脂質尾部與疏水表面的相互作用去除單個內毒素單體。
Fig.2 內毒素存在形式
內毒素污染主要來自兩大方面：
• 生產系統污染：在基因工程生產中，大腸桿菌常用于表達重組蛋白。在細胞破壁和純化過程中，細菌內毒素會大量釋放到溶液中，成為主要污染源。通常10%的濕菌濃度可產生幾萬EU/mL的內毒素。
• 原材料和環境污染：即便使用CHO細胞或酵母等不產生內毒素的表達系統，生產所用的原輔材料、溶液、生產環境以及操作過程中的污染，依然可能引入內毒素。
Fig.3 生產過程中內毒素污染控制
為了保障生物制品的安全性，內毒素檢測是必不可少的一環。常見的檢測方法包括：
本法作為最早的熱原檢查法仍收錄在現行版《中國藥典》中。由于家兔對熱原的反應與人基本相似，所以采用家兔耳緣靜脈注射的方式，監測家兔體溫，用來定性檢測熱原。這種方法較為傳統，但在敏感性和環保性方面有所限制。
鱟試劑（LAL）法
鱟試劑（LAL）法包括凝膠法和光度測定法，其中凝膠法包括凝膠限度試驗和凝膠半定量試驗兩種，為《中國藥典》規定的“仲裁”方法；光度測定法又分為濁度法（包括終點濁度法和動態濁度法）和顯色基質法（包括終點顯色法和動態顯色法）。該方法利用鱟試劑中的凝膠酶與內毒素反應，被廣泛用于檢測。其具有操作簡便、靈敏度高的優點。
重組C因子法
以重組技術生產C因子作為替代試劑，不僅能夠有效檢測內毒素，還避免了對自然資源（鱟蟹）的過度依賴，具有環保和可持續性的優勢。
Fig.4 內毒素檢測發展史
如何有效去除生物制品中的內毒素成為生物制品安全性與質量保障的關鍵。內毒素的結構特征是去除細菌內毒素的基礎，目前已形成多種內毒素去除層析工藝，包括疏水層析法、離子交換層析法、親和層析法和凝膠過濾法等。
利用內毒素在pH>2時帶負電的特性，通過帶正電荷的填料結合并去除。陰離子交換層析法適用于低鹽濃度條件下的樣品。可使用流穿模式，上樣前將樣品pH控制在目的蛋白pI以下，使其帶正電。這樣內毒素結合在填料上，目的蛋白直接流穿。
疏水層析
疏水層析法利用高鹽增加蛋白疏水性與介質結合。在高鹽體系中，內毒素由于脂質A部分有很強的疏水性發生凝集，無法與層析介質結合，因此能夠有效去除內毒素。
凝膠過濾層析
內毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為1,000kDa 分子聚集體，它與多數生物蛋白分子量差異較大。基于這一特征，可以采用凝膠過濾層析，將大分子內毒素分子與目標蛋白分離。
親和層析
使用特異性吸附內毒素的配基（如多粘菌素B），能夠高效去除樣品中的內毒素。
復合模式層析
結合電荷、疏水性和氫鍵等多種相互作用機制，復合模式填料能夠在一步操作中高效去除內毒素，適用于要求高純度的產品。
內毒素的檢測與去除是確保生物制品安全性和高質量生產的核心步驟。通過科學選擇去除技術和高效的層析填料，不僅能有效降低內毒素含量，還能提升純化效率，符合嚴格的國際法規標準。為應對內毒素去除的挑戰，博格隆推出了一系列高效的層析產品，為生物制藥行業提供可靠的解決方案，助力企業提升產品質量和效率。
