外泌體與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)研究介紹
近年來，神經(jīng)退行性疾病（neurodegenerative disease，ND）的發(fā)病率和死亡率呈不斷升高的趨勢，它是一類起病隱匿的進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期確診困難，因此尋找有效的生物標(biāo)志物在ND患者的早期診斷、臨床治療和預(yù)后監(jiān)測的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。隨著對ND研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)大腦中所有細(xì)胞（包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）分泌的外泌體，都在細(xì)胞通信中發(fā)揮關(guān)鍵作用，一方面，外泌體不僅在細(xì)胞內(nèi)短距離傳播信號，而且通過血腦屏障廣泛傳播到整個大腦。另一方面，外泌體進(jìn)行細(xì)胞間通訊時(shí)可以攜帶神經(jīng)退行性疾病中病理性錯誤折疊蛋白，從而加快疾病的進(jìn)展。
現(xiàn)對外泌體的一般特性、外泌體與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病相互關(guān)系及其對于神經(jīng)退行性疾病診斷和治療的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行概述。
圖1 神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病
一、外泌體概述
1983年，Pan和Johnstone團(tuán)隊(duì)首次在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟過程中，發(fā)現(xiàn)了一種與轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放到細(xì)胞外途徑相關(guān)的小囊泡，并于1989年定義為外泌體（exosome）。最初，外泌體被認(rèn)為是一種清除細(xì)胞代謝廢物的運(yùn)輸工具，越來越多的研究表明，外泌體在細(xì)胞通訊過程中起重要作用，能夠反映并影響細(xì)胞的生理、病理狀態(tài)，其中某些分子成份與疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療有密切聯(lián)系。
圖2 外泌體
細(xì)胞外囊泡根據(jù)其直徑大小可分為三種，分別為凋亡小體(50～5000 nm)、微泡(100～1000 nm)、外泌體(30～150 nm)。外泌體與細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生的小囊泡不同，外泌體只能由活細(xì)胞分泌，且能被體內(nèi)多種類型細(xì)胞分泌，廣泛存在于各種體液。外泌體通過胞吞-胞吐方式由親本細(xì)胞釋放；首先，胞膜內(nèi)化形成胞內(nèi)體，胞內(nèi)體聚集形成多泡體(Mullivesicular Bodies, MVBs)，MVBs與親本細(xì)胞膜融合，通過胞吐作用將外泌體排出細(xì)胞。
圖3 外泌體的釋放與通訊
在釋放到細(xì)胞外環(huán)境后，外泌體通過近分泌、旁分泌和內(nèi)分泌等三種方式進(jìn)行生物信息的交換和傳遞，在被受體細(xì)胞攝取后，其內(nèi)載的DNA、mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組分通過改變轉(zhuǎn)錄和翻譯程序影響蛋白質(zhì)的修飾和定位，調(diào)節(jié)信號級聯(lián)通路、關(guān)鍵酶反應(yīng)等影響受體細(xì)胞的表型和功能。
1.2 外泌體的通訊作用外泌體與靶細(xì)胞交流通過以下方式：（1）外泌體膜與受體細(xì)胞膜相互融合，釋放所攜帶物質(zhì)進(jìn)入受體細(xì)胞。（2）通過配體受體之間相互作用激活信號通路。（3）細(xì)胞通過胞吞作用將整個外泌體內(nèi)化后，與溶酶體融合，將所攜帶物質(zhì)釋放入受體細(xì)胞。此外，內(nèi)化后的外泌體還可以與MVBs融合，再次被分泌出細(xì)胞外。
1.3 外泌體的組成外泌體由構(gòu)成性分子和運(yùn)載分子共同組成，構(gòu)成性分子取決于釋放外泌體的親本細(xì)胞種類，其外側(cè)雙層膜結(jié)構(gòu)主要成分為脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。外泌體的構(gòu)成及運(yùn)載分子包括RNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)包括四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82 )、Flotillin、Alix、TSG101和熱休克蛋白(Hsc70、Hsp90)等，四次跨膜蛋白常被作為外泌體鑒定標(biāo)志物。Flotillin主要用于膜蛋白之間的相互交流與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究表明FlotiUin可作為阿爾茲海默病(Alzheimer disease, AD )診斷的新型標(biāo)志物。外泌體還攜帶有mRNA、miRNA、IncRNA、circRNA，并轉(zhuǎn)移至其它細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用，成熟miRNA的一條單鏈可與某些蛋白質(zhì)相互作用，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。不同外泌體的運(yùn)載分子不盡相同，這與外泌體親本細(xì)胞和外泌體形成過程中各種生理和病理?xiàng)l件有關(guān)。
圖4 外泌體的組成
2.1 外泌體與阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）
AD的病理特征為β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉積形成神經(jīng)炎性斑，及過度磷酸化Tau蛋白在神經(jīng)元內(nèi)形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)。AD患者的病理斑塊中有大量的Aβ及外泌體特定標(biāo)志蛋白Alix存在，Rajendran等發(fā)現(xiàn)Aβ可通過外泌體分泌至細(xì)胞外，并證實(shí)了外泌體具有在細(xì)胞間傳播毒性Aβ和高磷酸化Tau蛋白的能力，當(dāng)外泌體途徑被阻斷可減弱Aβ聚集和傳播。有研究報(bào)告：小膠質(zhì)細(xì)胞減少可以抑制Tau蛋白增殖，小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體合成受到抑制，可降低Tau蛋白的繁殖與傳播，這說明小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體在AD的發(fā)生發(fā)展中同樣具有重要研究價(jià)值。另有研究發(fā)現(xiàn)：輕度至重度的AD患者，腦脊液外泌體中磷酸化Tau蛋白濃度顯著高于早期階段，這表明外泌體相關(guān)的磷酸化Tau蛋白與疾病的進(jìn)展有關(guān)。
圖5 外泌體與阿爾茨海默病
帕金森病（Parkinson′s disease，PD），也常被稱為“震顫麻痹”，是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。這個疾病的主要原因是由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退化和死亡，可能與遺傳、環(huán)境因素及神經(jīng)系統(tǒng)老化等多種因素有關(guān)。PD 是僅次于 AD 的第二大類神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，65歲以上人群發(fā)病率為2% 。其病理特征是α-突觸核蛋白(α-synuclein, α-syn)構(gòu)成的路易小體(Lewy Body，LB)在神經(jīng)元胞體和軸突內(nèi)沉積。目前認(rèn)為神經(jīng)元功能受損甚至死亡是由α-syn寡聚體引起的。
α-syn是大腦中大量存在的一種可溶性蛋白質(zhì)，尚不明確其健康狀態(tài)下的功能，但錯誤折疊和纖維狀聚集的α-syn沉積在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中將導(dǎo)致一系列α-突觸核蛋白病發(fā)生。
α-syn可被分裝入外泌體釋放到細(xì)胞外環(huán)境，導(dǎo)致類似于朊病毒樣的病理傳播。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD患者血清外泌體中α-syn含量多于正常對照組，且α-syn以寡聚體形式存在于血清外泌體中；但PD患者腦脊液總α-syn含量低于正常對照組，可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于某種保護(hù)機(jī)制向血液系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)α-syn增加，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。將PD患者血清外泌體接種細(xì)胞，可致其表達(dá)α-syn單體及寡聚體增加；且用PD患者腦脊液外泌體接種健康小鼠，會使小鼠腦脊液中α-syn的表達(dá)水平呈劑量依賴型增加，故PD患者血清和腦脊液外泌體可以促進(jìn)靶細(xì)胞中α-syn形成。依賴于完整的外泌體傳播途徑，與游離α-syn相比，外泌體中α-syn更容易被受體細(xì)胞內(nèi)化，在神經(jīng)系統(tǒng)傳播中，毒性更大。
外泌體形成和分泌過程受自噬—溶酶體途徑(ALP)調(diào)節(jié)。ALP異常時(shí)，蛋白質(zhì)清除能力下降，并影響PD及DLB的發(fā)生發(fā)展；ALP受損將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)α-syn寡聚體的清除效率降低，引起α-syn寡聚體向細(xì)胞外釋放增加，導(dǎo)致外泌體中α-syn寡聚體在細(xì)胞間傳播，加速疾病進(jìn)展。
小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是傳播α-syn寡聚體導(dǎo)致PD進(jìn)展的潛在載體。用α-syn處理BV-2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)α-syn可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌外泌體增加，將此外泌體與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)可致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增多，說明外泌體在小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)PD的進(jìn)展過程中扮演重要角色。
多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性自身免疫性脫髓鞘疾病，主要累及腦、脊髓和視神經(jīng)。其主要病理改變包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘、炎性浸潤和軸突破壞等。
外泌體在多發(fā)性硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。其在體內(nèi)外均可促進(jìn)免疫炎癥因子的趨化和聚集。多發(fā)性硬化的特效藥物可降低腦脊液中外泌體的數(shù)量，提示外泌體可以作為多發(fā)性硬化的標(biāo)志物之一。炎癥狀態(tài)下，外泌體的表達(dá)增加，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)、外炎癥介質(zhì)（IL-1β、IL-6、COX2、iNOS等）的交換，炎癥因子的釋放，也促進(jìn)免疫細(xì)胞的趨化，免疫細(xì)胞反過來增加含炎癥因子的外泌體的釋放，從正反兩相促進(jìn)疾病進(jìn)程。
研究提示外泌體在MS的病理生理和發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。在MS患者的血清和腦脊液中外泌體含量明顯升高，外周炎性細(xì)胞通過釋放含有γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎性細(xì)胞因子的外泌體，進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，破壞血腦屏障，介導(dǎo)MS發(fā)病。內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、血腦屏障通透性升高，進(jìn)而使外周激活的淋巴細(xì)胞更易經(jīng)損傷的BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，繼發(fā)脫髓鞘、軸突破壞等一系列典型病理損傷。另一方面，這些囊泡中表達(dá)的炎性細(xì)胞因子打破Th17和TregT細(xì)胞之間的平衡，促進(jìn)疾病進(jìn)展。
MS至今尚無高度特異的生物學(xué)標(biāo)記物。近年的研究表明，MS患者的血清和腦脊液中所含外泌體可以作為一種診斷標(biāo)志物。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌體中含有50多種蛋白質(zhì)，且有30種已被報(bào)道與MS的疾病進(jìn)展有關(guān)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，外泌體不僅可早期診斷MS，更可以區(qū)別MS亞型。在不同亞型的MS患者分離的外泌體含有不同的miRNA，揭示了外泌體的檢測可以作為一個更簡便更有效的診斷手段。
2.4 外泌體與其他退行性疾病肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種進(jìn)展迅速的神經(jīng)退行性疾病，以運(yùn)動神經(jīng)元丟失、隨意肌麻痹等為特征。在ALS患者的細(xì)胞外泌體中發(fā)現(xiàn)了錯誤折疊的蛋白質(zhì)，如mSOD1、FUS、TDP43和C9orf72擴(kuò)張DPRS等神經(jīng)毒性成分。
視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是視神經(jīng)與脊髓同時(shí)或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變。通過對NMO患者的腦脊液分離出的外泌體的蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)含的NMO標(biāo)志性蛋白（例如膠質(zhì)細(xì)胞纖維原酸性蛋白GFAP）的表達(dá)有特異性的增加，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)相一致。與此同時(shí)，MS、特發(fā)性縱橫肌炎（I-LETM）的特異性標(biāo)志物也有相應(yīng)表達(dá)。提示我們可以將腦脊液外泌體分析作為神經(jīng)系統(tǒng)免疫疾病鑒別診斷的手段之一。
這些研究和結(jié)果為外泌體診斷和治療神經(jīng)退行性疾病提供了有力的證據(jù)，但還需要深入研究這類疾病的機(jī)制，并將這一知識轉(zhuǎn)化為臨床中的應(yīng)用，從而為疾病治療帶來希望。
三、外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的應(yīng)用價(jià)值外泌體存在于各種體液中，便于獲得，其成分特異，所攜帶物質(zhì)不僅能反映親本細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)，并且外泌體可保護(hù)其攜帶的miRNA、蛋白質(zhì)等穩(wěn)定存在，不被核酸酶和蛋白酶降解，因此，可成為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的診斷重要標(biāo)志物；因其具有穿過血腦屏障的功能，對其進(jìn)行修飾、裝載，將成為藥物治療的載體，可在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療中發(fā)揮重要的作用。
3.1 外泌體與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的診斷神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病起病隱匿，早期無明顯臨床癥狀，但生物特性的變化已經(jīng)在外泌體中體現(xiàn)，因此，外泌體的改變可為疾病早期診斷提供依據(jù)。目前PD的診斷多依賴于臨床癥狀，但當(dāng)紋狀體中70%至80%和黑質(zhì)中50%的多巴胺能神經(jīng)元丟失時(shí)才出現(xiàn)運(yùn)動癥狀，因此，PD早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物有待進(jìn)一步明確，人們正在嘗試從腦脊液、血液、尿液中提取外泌體及外泌體攜帶物質(zhì)進(jìn)行PD早期診斷的探索。
與腦脊液相比，血液和尿液樣本更易獲得，但外周血中血小板和紅細(xì)胞會產(chǎn)生大量的α-syn，若制備樣本時(shí)發(fā)生溶血則影響血漿外泌體中α-syn檢測結(jié)果。在PD患者尿液外泌體中可檢測到與PD相關(guān)的LRRK2蛋白，但由于LRRK2在人體內(nèi)表達(dá)多變，不能得到穩(wěn)定的檢測結(jié)果，因此不能用于PD的早期診斷。DJ-1是一種由189個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，具有抑制α-syn聚集的作用，有研究發(fā)現(xiàn)男性PD患者尿液外泌體中DJ-1與正常人存在明顯差異，但研究樣本量較小，能否成為未來診斷標(biāo)志物仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。
腦脊液可直接反映腦內(nèi)病理變化，故使用腦脊液外泌體樣本對疾病診斷更精確，但不易獲得。對腦脊液外泌體miRNA分析發(fā)現(xiàn)PD患者腦脊液外泌體較正常對照組有16個miRNA表達(dá)上調(diào)，11個miRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-153、miR409-3p、miR-10a-5p顯著過度表達(dá)，這些差異有望成為PD早期診斷標(biāo)志物。
Aβ在腦內(nèi)沉積是一個長期緩慢過程，對AD臨床前期診斷有助于早期干預(yù)疾病發(fā)生發(fā)展。研究表明AD患者血漿腦源性外泌體中總Tau蛋白、P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ-142水平均顯著高于正常對照組，在認(rèn)知正常的高危患者中可檢測到磷酸化Tau蛋白、P-S396-tau和P-T181-tau，這些改變可追溯到AD診斷的10年前。動態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)，從臨床前的高危人群到AD確診，患者血漿外泌體Aβ1-42水平由逐漸升高到顯著增高，因此，血漿外泌體Aβ1-42具有刻畫AD進(jìn)展的價(jià)值。
外泌體的標(biāo)志蛋白Flotillin是位于外泌體脂筏上的疏水性蛋白，可通過影響Ca2+穩(wěn)態(tài)、線粒體功能參與AD的發(fā)病。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)：與非AD人群相比，AD患者腦脊液和血清中Flotillin水平顯著下降，用正電子發(fā)射斷層攝影(PET)成像技術(shù)分析Aβ沉積，發(fā)現(xiàn)血清Flotillin水平與Aβ沉積負(fù)相關(guān)，這表明血清Flotillin 水平可用來評估Aβ沉積，可用于早期診斷。
3.2 外泌體與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療外泌體經(jīng)改造后可回輸至自體，減少因藥物載體帶來的免疫反應(yīng)，提高治療的安全性，且由于其能夠通過血腦屏障，故可用外泌體作為藥物載體對神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)行靶向治療。中國研究團(tuán)隊(duì)通過飽和溶液孵育法，成功有效的將多巴胺裝載入血漿外泌體中，通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，裝載入血漿外泌體的多巴胺透過血腦屏障，被成功傳送至大腦的黑質(zhì)和紋狀體，且多巴胺在腦內(nèi)分布增加了15倍以上。有研究團(tuán)隊(duì)將過氧化氫酶(強(qiáng)效抗氧化劑)在不改變外泌體結(jié)構(gòu)的情況下裝載入外泌體，攜帶過氧化氫酶的外泌體透過血腦屏障，富集在神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)揮強(qiáng)大的保護(hù)作用。上述的研究結(jié)果將為PD、AD及其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療提供新的方法。
四、小結(jié)隨著人口老齡化加劇，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病率越來越高，給患者、家庭及社會帶來巨大影響，探究其病理，對其進(jìn)行早期診斷、早期干預(yù)成為當(dāng)下解決問題的重點(diǎn)。
近年來學(xué)術(shù)領(lǐng)域?qū)ν饷隗w的結(jié)構(gòu)和功能等的研究有了重大突破，已有多項(xiàng)研究證實(shí)外泌體在ND病理和治療過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，外泌體自身的優(yōu)越性使其成為細(xì)胞間通訊的重要媒介，在調(diào)節(jié)正常生命活動和疾病的診斷和治療中能發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)功能。作為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，外泌體受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。對外泌體進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病有巨大聯(lián)系，雖然目前僅在研究階段，實(shí)際應(yīng)用還面臨諸多困難，但其仍不失為一種有前途的方法。
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