His標簽由于其分子量小、與金屬離子結合能力強以及在變性條件下也可保持與介質結合的特性，已成為最常用的親和標簽。固定化金屬離子親和層析（IMAC）原理為：暴露在蛋白質表面的某些氨基酸側鏈（主要是His，及少量的Cys和Trp），可與過渡金屬離子之間發生特定的可逆性相互作用，從而實現對蛋白的分離純化。金屬離子通常為Zn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺或Co²⁺，如今用Ni²⁺固定化金屬離子親和層析已成為純化組氨酸標簽蛋白的標準方法。蛋白質/肽與固定化金屬離子相互作用的強度取決于氨基酸側鏈的類型、數量和空間分布，以及所使用的金屬離子的性質。
 

常見的Ni螯合方式：
 
 

Ni填料在獸用亞單位疫苗的應用
 
基因工程亞單位疫苗，在表達載體序列中加入His-tag標簽以達到快速層析純化獲得目標蛋白，發酵培養后通過金屬螯合親和層析填料Ni Chromstar FF或Ni Chromstar Excel一步層析純化即可獲得較高純度的目標蛋白，經Puredex G-25 M或UF/DF進行緩沖液置換即可進行制劑配苗。
 
典型案例：百林科Ni填料在重組亞單位疫苗的應用：
   

由圖可知，發酵后菌體破碎澄清后經一步Ni填料親和層析純化后，目標蛋白純度高，后續經濃縮與換液后即可進行后續制劑配苗。
    由圖可知，重組膠原蛋白經一步Ni Chromstar FF純化后可得較高純度蛋白洗脫液，后續經Puredex G-25 M脫鹽換液后再進行離子交換層析精純可得高純度重組膠原蛋白。
 
不同Ni螯合方式純化效果對比（另一重組膠原蛋白）
 
 
1、Ni Chromstar FF與Ni Chromstar Excel均可用于純化重組膠原蛋白；
 
2、Ni Chromstar Excel洗脫純度明顯較Ni Chromstar FF高，對于雜質的去除有顯著的改善效應。
 
鑒于以上情況，Ni親和填料在各種重組蛋白項目上應用較多，而實驗中也會經常遇到各種問題，該如何解決吶？以下匯總了常見問題以及對應解決方法：

01 His標簽蛋白與親和介質不結合
① His標簽未翻譯表達
解決思路：
Ø 使用Western blot方法檢測His標簽是否表達
Ø 重新構建目的蛋白分子，改變插入His標簽的位置（C端或N端）
 
② His標簽暴露不充分
解決思路：
Ø 向樣品中加入一定量變性劑（如：3～8 M尿素，3～6 M鹽酸胍等），再上樣純化
Ø 重新構建目的蛋白分子，適當增加組氨酸基團個數，或在His標簽與目的蛋白之間加入一段Linker

02 His標簽蛋白純化后純度低
① 介質的離子交換作用，導致了非特異結合
解決思路：
Ø 在平衡液、樣品、洗脫液中，加入0.5 M NaCl，屏蔽介質的離子交換作用

② 雜蛋白也能與金屬離子結合
解決思路：
Ø 調整樣品與介質的結合條件，比如預先在樣品及平衡液中加入10～50 mM咪唑，屏蔽與介質弱結合的蛋白
Ø 洗脫過程采用梯度洗脫方法，摸索最佳純度條件
Ø 嘗試其他金屬離子螯合親和層析介質
Ø 在目的蛋白分子上額外構建一個蛋白標簽，如：GST標簽，兩步純化目的蛋白，或銜接其他純化方法進一步純化

③ His標簽蛋白被降解
解決思路：
Ø 細胞破碎過程中釋放的蛋白酶可能會降解目的蛋白，導致帶有His標簽的小片段產生，形成產品相關雜質，可以在處理樣品過程中加入一定量蛋白酶抑制劑
Ø 如果目的蛋白自身不穩定，會發生降解，則需要摸索維持目的蛋白穩定的最佳條件，包括溫度、緩沖液成分和操作時間等

03 His標簽蛋白無法洗脫
① 目的蛋白與介質結合能力過強
解決思路：
Ø 進一步增加洗脫咪唑濃度，或同時適當降低pH值
Ø 通過脫落金屬離子，進行洗脫，可用pH值3.5條件或EDTA進行洗脫
 
② 目的蛋白沉淀在層析柱內
解決思路：
Ø 摸索維持目的蛋白穩定的最佳條件，包括溫度、緩沖液成分和操作時間等
Ø 適當降低上樣量
Ø 用變性劑洗脫，如8 M尿素或6 M鹽酸胍
 
04 層析介質變色
① 介質長期使用，出現白色
解決思路：
Ø 如果介質長期使用，或單次使用上樣量較大時，會導致介質金屬離子脫落，從而導致介質變白，可通過介質再生解決
Ø 如果介質表面結合了大量目的蛋白，在純化過程中，會略顯白色，洗脫后顏色會恢復，屬于正常現象

② 介質在純化過程中，出現棕色
解決思路：
Ø 介質在純化過程中變成棕色，主要是受緩沖液或樣品中還原劑的影響，可以選擇去掉還原劑成分，或者使用Ni Chromstar Excel介質

③ 介質長期使用過程中，出現黃色
解決思路：
Ø 介質在使用過程中，會積累非特異性吸附的雜質，包括蛋白、色素等。同時在層析柱頂端也會積累沉淀蛋白，長期使用后，就會出現介質頂端發黃的現象。此時，往往伴隨著介質載量降低、柱效降低、柱壓變大等情況。可通過在位清洗方法，系統的對層析柱進行清洗，解決這一問題，并建立合理的介質壽命維護方法
 
 

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