腫瘤的發展除了與癌細胞自身基因突變導致的惡性增殖有關以外，還與腫瘤微環境息息相關。在癌癥中，正常組織中和諧的細胞相互作用關系被破壞，原本保護正常細胞生存的微環境在腫瘤細胞的影響下，逐漸演變成適應腫瘤生長的條件。針對腫瘤微環境的檢測和表征研究也可為癌癥治療提供新的思路。
 
目前空間多組學技術已用于研究幾種類型癌癥中腫瘤免疫微環境的轉錄組、蛋白質組和代謝組，從這些方法獲得的數據已與免疫組化和多參數分析相結合，以產生癌癥進展的標記物。傳統分析技術受樣品空間分辨率以及分析靈敏度的限制，無法精準獲取靶向部位，而對其中特異代謝物的差異表征就更加困難。組織切片伴隨著顯微鏡技術等的發展而得到廣泛的應用，而激光顯微切割 (LMD, laser microdissection) 技術可以方便地對特定的組織區域的精確分離（圖2）。結合高靈敏度的液質聯用檢測技術，基于ZenoTOF^® 7600 系統，將空間定位準確的微區細胞代謝譜進行全面準確的表征。代謝譜是免疫微環境的重要調節因子，可能通過影響癌細胞的增殖潛能和適應環境而發揮作用。代謝特征的異質性似乎有助于腫瘤免疫微環境的異質性。
   
腫瘤微區樣品制備
 
由制備好的腫瘤組織切片樣本置于激光顯微切割載物臺，確定好焦距平面后，將視野移動到待切割的細胞區域（先通過H&E染色的平行樣本確定腫瘤組織分區），在調節好相關參數后開始進行切割。通過對樣本分別進行水溶性代謝物和脂溶性代謝物的提取，進而進行基于液質聯用系統的全面的代謝組學分析。
 

 
圖2. 組織切片樣本用于激光顯微切割分離體制備。經過蘇木精-伊紅（HE）染色確定組織切片中不同類型的細胞區域（左）包括原位癌、浸潤癌和癌旁細胞，在平行的未染色組織切片中的相應位置進行激光顯微切割獲得分離體（右）。
 
代謝物全面表征
 
組織細胞中代謝物成分復雜多樣，且有較多同分異構體，僅有準確的高分辨一級無法對化合物進行確證。針對大量樣本，SCIEX OS軟件可自動進行峰提取和搜庫，通過一級質量數、同位素豐度和二級碎片的匹配對樣本中的代謝物進行鑒別（圖3），使篩查流程快速準確。在代謝組學的樣本中共鑒定173個化合物，包括氨基酸類、核苷類、吲哚類、脂肪酸類等。
 

 
圖3. 代謝物鑒定界面示例。以樣本中鑒定到的脯氨酸（Proline）為例，Proline分子式為C₅H₉NO₂，檢測到的MS信號與理論質荷比相比，質量數偏差為-0.3ppm，同位素豐度比與理論值偏差為1.3%，MSMS與代謝物庫中Proline的標準譜圖匹配度為100，以此可判定鑒定到的信號為Proline。
 
在脂質組學分析樣本中共鑒定到550個脂質化合物，基于ZenoTOF^® 7600 系統特有的電子活化解離（EAD）碎裂模式，可以鑒定出其中一些脂質化合物的精細結構，如脂肪酸鏈連接的具體位置（sn1或sn2）以及連接的不飽和脂肪酸雙鍵的具體位置（圖4）；對于樣本中檢測到的脂質化合物包括固醇酯類、神經酰胺類、溶血磷脂膽堿類、磷脂膽堿類、溶血磷脂乙醇胺類、磷脂乙醇胺類、磷脂肌醇類、磷脂絲氨酸類、鞘酯類、甘油二酯類、甘油三酯類。
 

 
圖4. 脂質化合物精細結構鑒定示例。以甘油三酯TG (18:1/18:1/18:1)為例，在EAD碎裂模式下，化合物[M+Na]+峰可以產生特征的碎片離子，幫助解析甘油三個羥基各自所連接的脂肪酸組成，以及在高質荷比區域產生的連續CH2斷裂碎片確定不飽和鍵的位置（C9和C10間為雙鍵）。
 
差異代謝物分析
 
在質控樣本（quality control, QC, 所有樣本等體積混合，整個分析批次中每6個樣本穿插一針QC樣本進樣）中，化合物峰面積RSD%不超過30%（n=8），在代謝組學樣本中共檢出100個代謝物，脂質組學樣本中共檢出502個代謝物，并將這些化合物在所有的樣本包括原位癌組織、浸潤癌組織、癌旁組織進行峰面積提取。
 
將獲得的各種組織中化合物含量信息進行生物統計學分析，以浸潤癌組織v.s.癌旁組織為例，共找到84個差異代謝物（圖5）。經過后續進一步生物學驗證，確定的差異代謝物可以幫助開展癌細胞在空間定位及異質性的精準區分工作，更好的理解例如腫瘤轉移的起源和發展、侵襲能力、對藥物的敏感性等方面的特點，從而制定個體化的精準治療方案。
 

 
圖5. 浸潤癌組織v.s.癌旁組織中的差異代謝物熱圖。通過統計學分析，包括t-test的p值小于0.05以及PLSDA計算的VIP值不小于1作為篩選條件，獲得了84個差異代謝物。
 
總結
 
通過對組織切片進行激光顯微切割獲取空間定位準確的微量樣本，并與SCIEX ZenoTOF^® 7600 系統相結合，實現微量細胞水溶性和脂溶性代謝物的全面表征以及高靈敏度組學分析。可將此方案應用于其他組織切片樣本，助力空間多組學研究的開展。
 
致謝：
感謝廈門大學生命科學學院林樹海教授及其課題組成員華錚翼、姚博對方案中組織切片和樣本制備的支持；
感謝丹納赫生命科學平臺徠卡顯微系統公司高天龍、連其林對顯微切割技術的支持。
 
空間多組學研究質譜平臺：
多重碎裂高分辨質譜
SCIEX ZenoTOF^® 7600 系統：

 
ZenoTOF^® 7600 系統于2021年推出即獲得國際“分析科學家創新獎”之首，集成了多項前沿新技術，包括：
 
能實現更高二級質譜靈敏度的Zeno^™ Trap (Zeno 阱) 技術；
能與經典CID碎裂技術互補的電子活化解離 (EAD) 技術；
升級的133Hz超快速二級質譜掃描能力；
新一代全景質譜Zeno SWATH^® DIA數據依賴型采集技術等。
 
多重碎裂質譜ZenoTOF^® 7600 系統的卓越性能，極大提升生命科學多組學研究的深度和廣度，尤其在高通量高深度蛋白質組學、蛋白質翻譯后修飾（尤其是糖蛋白質組學）、全景非靶向代謝組學、脂質精細結構解析等尖端領域獲得廣泛應用。