卵巢癌是卵巢腫瘤的一種，是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一。由于卵巢癌早期缺少癥狀，即使有癥狀也不特異，篩查的作用又有限，因此早期診斷比較困難，而晚期病例又療效不佳。雖然卵巢癌的發病率低于宮頸癌和子宮內膜癌居婦科惡性腫瘤的第三位，但死亡率卻超過宮頸癌及子宮內膜癌之和，高居婦科癌癥首位，是嚴重威脅婦女健康的疾病之一。本期小編給大家介紹幾個卵巢癌的大隊列樣本分析的經典案例。
卵巢癌
 
案例一
利用不同蛋白質組學分析策略研究CT45—卵巢癌的化療敏感性介質與免疫治療的新靶標
大多數高級別漿液性卵巢癌(HGSOC)患者對鉑類化療產生耐藥性并復發，但也有15%的患者在10年以上仍然無病。為了發現長期生存的驅動因素，由芝加哥大學醫學研究小組等研究者定量分析了微量福爾馬林固定石蠟包埋腫瘤中鉑耐藥和敏感HGSOC患者的蛋白質組學分析，運用了基于質譜的定量蛋白組學、磷酸化蛋白組學技術，針對卡鉑耐藥和卡鉑敏感患者進行分析，探究高級別漿液性卵巢癌患者的長期生存的驅動因素。相關研究成果發表在國際專業學術期刊《Cell》上。
 
研究者將25例來自美國芝加哥大學未接受化療的卵巢癌組織樣本庫的HGSOC組織樣本，用基于質譜法的蛋白組學方法將組織樣本分離，并使用微量FFPE（石蠟包埋）樣品鑒定和定量到9000多種蛋白，定量動態范圍高達6個數量級。在分析了9000余種蛋白水平后，發現CT45是高級別漿液性卵巢癌患者獨立預后因子。為了對這一發現進行驗證，研究者檢測了200余例卵巢癌患者腫瘤組織，發現其中82例患者腫瘤組織中無CT45表達，42例高表達，隨訪研究發現CT45高表達患者無病生存期均較長，壽命相比CT45缺乏的患者提高了7倍。再次證實了CT45是晚期高級別漿液性卵巢癌的獨立預后因子。

圖1 基于高分辨質譜Orbitrap的HGSOC蛋白質組學分析流程（點擊查看大圖）
 
此外，研究者對化療反應的分子機制也進行了探討，卡鉑的標準化療能引起卵巢癌的DNA損傷，而卡鉑化療在CT45高表達腫瘤細胞中帶來的DNA損傷更為顯著，可導致培養的細胞死亡和小鼠腫瘤縮小。為了進一步研究CT45介導的化療敏感性原因，研究者利用定量互作蛋白組學分析發現CT45與進化保守的蛋白質磷酸酶4（PP4）復合物的相互作用，CT45是PP4信號傳導的新型內源調節因子，通過抑制PP4參與DNA損傷途徑。而CT45過表達有效提高了腫瘤細胞的化療敏感性！未來通過激活腫瘤細胞中的CT45表達有望提高鉑類化療的療效。

 
該研究認為CT45是卵巢癌獨立預后因子，與晚期卵巢癌患者無病生存期較長顯著相關且可作為鉑類敏感性調節劑和卵巢癌的免疫治療靶點。這是第一個基于質譜法的蛋白組學發現的預后和功能性的生物標志物，運用了包括shot-gun蛋白質鑒定、LFQ蛋白質定量、磷酸化蛋白質組學、蛋白質相互作用組學以及免疫肽組學，可見臨床癌癥蛋白質組學鑒定化療和免疫療法靶點具有非常顯著的臨床意義。
 
 
案例二
高級別漿液性卵巢癌蛋白質組學研究—
揭示卵巢癌轉移機理
2019年5月，Nature上發表了標題為Proteomics reveals NNMT as a master metabolic regulator of cancer-associated fibroblasts的卵巢癌研究內容（*由芝加哥大學的Ernst Lengyel團隊發表）。該研究通過將激光捕獲顯微切割(laser-capture microdissection)與基于Orbitrap蛋白質組學分析策略結合，對臨床石蠟包埋組織樣品中細胞進行研究，最少可做到5000個細胞。通過聯合運用，他們發現與腫瘤轉移密切相關的成纖維細胞(cancer-associated fibroblast，CAF)中調控蛋白N-甲基轉移酶(N-methyltransferase(NNMT))參與卵巢癌的發生發展以及轉移過程。
 
通過搜集了11位高級別漿液性卵巢癌（High-grade serous carcinoma，HGSC）病人107個組織樣本，然后使用顯微切割技術將腫瘤組織和基質分別提取進行蛋白質組學分析（流程見下圖）。
 
圖3 微量顯微切割腫瘤組織和基質樣品蛋白質組學分析流程（點擊查看大圖）
 
對于這種低濃度樣本，Orbitrap高分辨質譜可實現臨床石蠟樣本數據深度覆蓋，共鑒定到6944個蛋白，其中FABP4蛋白變化顯著，在網膜轉移(omental metastases)腫瘤中高表達，比較網膜轉移和原發型腫瘤基質，發現NNMT蛋白上調，NNMT介導催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的轉化。通過免疫組化實驗驗證了NNMT在網膜轉移的腫瘤基質中高表達，并且當CAF細胞中敲低NNMT后，細胞形態接近正常。
 
后續通過動物模型驗證蛋白表達趨勢，作者構建HGSC轉移小鼠模型，確認將NNMT敲低的CAF與HGSC細胞共同注射到小鼠體內，腫瘤細胞的增殖和腫瘤大小則顯著降低，并且用NNMT的抑制劑處理也能降低。通過臨床樣本數據分析，基質中NNMT高表達的病人預后更差，而在腫瘤組織中NNMT高表達的病人卻并沒有顯著差異。綜上研究作者推斷NNMT是調控高級別漿液性卵巢癌轉移的關鍵角色。
 
 
案例三
高分級漿液性卵巢癌早期診斷生物標志物的研究新策略
加拿大Thomas Kislinger教授團隊在Cell Systems上發表了高級別漿液性卵巢癌相關研究文章。在這篇研究中，研究者開發了一個使用臨床相關患者來源的異種移植物(PDX)和N-糖肽富集的工作流程，使用原位移植的PDX模型，可以在小鼠血清背景中輕松識別“人類獨特的”蛋白質，從而克服與基于蛋白質組學的生物標記物發現相關的限制，目的是鑒別腫瘤相關的人來源蛋白。
  圖4 基于高分辨質譜的異種移植物(PDX)和N-糖肽富集的工作流程（點擊查看大圖）
 
該研究2種不同的PDX模型，收集PDX-腫瘤和PDX-血清，以來自非移植的同基因小鼠血清（NEGsera）作陰性對照，運用label-free定量N糖基化蛋白質組加以分析。研究發現，與對照組NEG血清相比，PDX-血清樣本與PDX-腫瘤樣本存在顯著差異。各樣品類型中共鑒定到3922個糖基化位點，其中絕大部分糖基化位點（約2077多個位點）僅在PDX-腫瘤中發現分布。PDX-腫瘤和PDX-血清中定量到649個位點，表明這些肽可用作HGSC生物標記物。總之，基于PDX的N-糖蛋白組策略可以檢測血清中的腫瘤相關蛋白。
 
隨后通過生物信息學分析，作者獲得了PDX-血清中各種豐度的蛋白質功能注釋。作者將小鼠蛋白質定位到它們的人類直向同源物中，產生總共745種獨特的蛋白質。比較PDX-血清和PDX-腫瘤中定量到的1559個糖基化位點的強度，表明人類獨特的糖基化位點在PDX-腫瘤中具有更高的強度。為了能夠對來自HGSC患者的血清中的腫瘤相關肽進行定量，作者使用平行反應監測質譜（PRM-MS）系統地開發了靶向蛋白質組學測定。他們通過優化色譜梯度和標準化碰撞能量（NCE）來最大化測定響應，并通過使用穩定同位素標準（SIS）肽評估測定特異性。研究者快速開發了通過基于PDX的N-糖蛋白組學策略發現的408種肽的PRM-MS分析，成功率為90％。

圖5 使用平行反應監測質譜（PRM-MS）系統地對潛在標記物進行篩選（點擊查看大圖）
 
該篇文章開發的原位移植的PDX模型新策略，能夠識別潛在的新的腫瘤相關蛋白。最后，合成穩定的同位素標記肽的使能夠快速開發用于HGSC患者血清定量的靶向蛋白質組學分析，當然這一策略仍舊需要在更大的患者隊列中進行驗證。
 
 
Orbitrap
大規模的臨床樣本，完善的臨床預后信息，超高深度的蛋白質組學數據，精細縝密的生物學驗證，均需要高分辨率、高靈敏度、高質量精度、高穩定性的質譜儀器作為輔助手段。歷經多年風雨，Orbitrap質譜一直伴隨著蛋白質組學研究成長，終得碩果。賽默飛擁有蛋白質組學分析的最佳工具Orbitrap高分辨質譜儀，同時具有最全面、最完整的組學分析技術流程，實現從蛋白質功能到結構的解析，并具備充分的功能驗證手段，助力高水平研究成果產出。我們也更加期待蛋白質組學驅動精準醫學成果在未來預防、診斷、治療多方面的應用轉化，共同促進精準醫學飛速發展。
 
參考文獻：
 1. Multi-level Proteomics Identifies CT45 as a Chemosensitivity Mediator and Immunotherapy Target in Ovarian Cancer https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867418311668 
2. Proteomics reveals NNMT as a master metabolic regulator of cancer-associated fibroblasts https://www.nature.com/articles/s41586-019-1173-8 
3. N-Glycoproteomics of Patient-Derived Xenografts: A Strategy to Discover Tumor-Associated Proteins in High-Grade Serous Ovarian Cancer https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30981729/
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