簡化微生物實驗室的MALDI工作流程
作者:Markus Meyer,布魯克微生物學與診斷學
基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)作為微生物鑒定技術,應用已有十多年了,傳統生化方法需要數天時間才能得出結果,而且往往缺乏特異性,而MALDI-TOF 質譜儀則克服了上述局限性。MALDI作為一種用于質譜(MS)的軟電離方法,可實現對生物分子(如DNA、核糖體蛋白質、肽和糖)以及有機大分子(如聚合物和其它大分子)的分析。MALDI-TOF質譜儀也因此成為當今最先進的利用蛋白質組指紋技術鑒定細菌、酵母和真菌的技術。
快速準確的分析、便捷的樣品制備以及簡便的結果生成,使得MALDI-TOF質譜儀非常適合于常規的和高通量的微生物鑒定。為此,微生物樣品點在MALDI-TOF質譜儀靶板上的點位,并在分析前以特定的MALDI基質覆蓋,隨后將所獲得的質譜圖譜與參考譜庫進行匹配。MALDI-TOF 質譜儀靶板通常采用金屬、塑料或陶瓷,可將MALDI-TOF 質譜樣品點在單個點位上用于分析。MALDI-TOF 質譜儀靶板主要有兩種類型,即一次性靶板和可重復使用靶板。其關鍵的區別在于,可重復使用靶板需要在每次試驗之間進行徹底的清潔和檢查,而一次性靶板則即時可用。本文將討論一次性靶板在經濟、方便的微生物鑒定工作流程中的優勢。
快速、穩定的工作流程
在中、高通量實驗室(例如在制藥或食品工業)中,快速微生物鑒定是質量控制(QC)和及時交付所必需的,因此,高效、方便、快捷的工作流程至關重要。此外,在受到高度管制的行業(如制藥行業),QC方法必須通過實驗室驗證。可重復使用的MALDI鋼質靶板由微生物實驗室負責,因為它們需要一個必須經常被記錄的額外清潔步驟,作為遵循清潔程序的審查證據。然而,使用一次性靶板可直接支持規定環境下的工作流程,如ISO 15189。
一次性靶板可減輕清潔程序驗證的負擔,降低先前樣本的污染和記憶效應的風險。因此,當使用一次性MALDI靶板時,基于MALDI的工作流中有關質量管理(Quality Management, QM)的部分變得更加簡便,并能為管理和實驗室團隊節省時間,更能專注于其核心任務。
此外,這種即時可用的概念在需要檢測緊急樣品的情況下尤其有利;例如,在食品工業中,要求快速識別微生物污染,以決定是否召回或保留市場上的產品。
除了可重復使用靶板所需的額外清潔步驟外,一次性和可重復使用MALDI-TOF 質譜儀靶板的工作流是相同的,這使得在保持鑒定程序不變的情況下進行靶板切換變得簡單。此外,一次性靶板能提供與可重復使用靶板相同的性能表現。
在MALDI-TOF質譜儀市場上,有一系列不同尺寸和材質的一次性MALDI靶板供應。影響MALDI-TOF 質譜儀微生物鑒定的穩定性的重要因素之一,靶板表面的平整度。某些材料,如塑料,更易受到表面微小變化的影響,這可能導致譜圖中的質量偏差,并需要額外的校準孔。相反,構建在陶瓷基底上的靶板(圖1),具有完美的平整表面,無需預先確定校準位置,具有可在靶板上的任何位置應用校準物的靈活性,且整個一次性靶板都可以使用。在整個靶板上只需要一個校準位置就可以獲得很好的質量精度,這意味著有更多的點位可用于樣品檢測。此外,陶瓷材料非常堅固,因此,萬一靶板從實驗臺掉到地板上也不會斷裂。當一次性靶板尚未完全點滿樣本時,使用單個靶板進行多次MALDI-TOF采集,在軟件和工作流程上并無限制。例如,用戶可以先僅點樣幾個樣本并完成MALDI運行,隨后可再回來使用該靶板的空余位置點上其它的樣本并做檢測。
圖1:陶瓷一次性MALDI-TOF 靶板。圖片來源:Bruker Daltonics
成本因素
雖然一次性MALDI-TOF質譜儀靶板的前期成本可能稍高,但不存在使用或維護方面的隱藏成本。相比之下,對于可重復使用靶板,實驗室可能需要購買、儲存、使用并處置清潔程序所需的一系列有機化學品。除了所涉財務問題外,還需要額外考慮有機清潔溶劑,例如通風柜的使用及其維護、工作人員的額外安全協議以及適當的處置措施。
總之,在與可重復使用靶板進行直接成本比較時,需要考慮實驗室訂購、維護和處理此“日常運營”所需的全部時間。此外,有機溶劑的可用性和價格波動,也會給負責實驗室庫存的人員帶來挑戰,且有時很難預測未來的成本。
樣品制備
在高通量的實驗室里,微生物學家們可以通過使用一次性陶瓷靶板來節省等待液體樣本干燥的時間,在陶瓷靶板表面干燥要比在不銹鋼靶板表面快10%左右。
這些一次性靶板采用了旨在提供環繞親水性樣品位置或“錨點”的疏水表面的技術。這使得液體樣品能夠均勻地分布在靶點上,而不會在點位之間產生交叉污染(圖2)。避免靶板上各點位之間的交叉污染,是MALDI-TOF 質譜儀微生物鑒定工作流程的關鍵。
這種技術特別適用于慢干的液體樣品的制備,這些樣品更容易在各點位之間流動并造成交叉污染。由于液滴在疏水邊緣停止擴散并停留在親水錨點上,因此用戶能更容易地將樣本點在靶點上,避免了液滴在靶點上流動的風險。最后,對于需要添加更大體積(如3-5µl的樣本)的特殊樣品方案,錨定效應使大體積液滴集中于各自的點位,而不存在交叉污染的風險。
圖2:利用專利技術防止樣品在一次性陶瓷靶板上的點位之間流動。圖片來源:布魯克 道爾頓。
流程簡便的關鍵
即時可用的功能和簡化的工作流程,能帶來節省時間的益處,使一次性MALDI-TOF 靶板成為了中、高通量微生物實驗室的便捷解決方案。為了提高效率和節省時間,一次性靶板可與現成的細菌試驗標準品(BTS)及預配制的HCCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質一起使用,以實現簡單、安全、快速和準確的微生物鑒定。