張曉夕1,Yue Xuan2, 李靜1，顧培明1，吳澤明1，Application Group, LC-MS, CMD, Japan3

1 賽默飛世爾科技（中國）有限公司

2 Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany

3 Thermo Fisher Scientific, Yokohama, Japan

 

在最近十年中，非變性質譜（Native mass spectrometry） 正在逐漸成為非共價結合的完整蛋白復合物表征的重要技術手段 [1]。對于完整單克隆抗體（mAbs），非變性質譜可提供分子量、糖型等的精確測量結果，還可用于高級結構（二聚、三聚和四聚）的測定；非變性質譜正在成為一種具有穩健性、快速且可靠的一線分析表征工具[2,3]。

 

賽默飛世爾科技在2013 年國際HUPO 大會上發布的Thermo ScientificTM ExactiveTM Plus EMR 質譜儀結合了無以倫比的高分辨率精確質量Thermo ScientificTM OrbitrapTM 分析和擴展質量數范圍（EMR）功能，提供了一個出色的工具，用于研究類似天然狀態下保留有三級和四級結構的蛋白質和蛋白質復合物的結構學、拓撲學和構造。可用于單克隆抗體的純度、PEG 修飾的蛋白質、低聚蛋白藥物、糖型和組裝蛋白質的表征。同時，Exactive Plus EMR 質譜儀的全面分析性能使之成為篩查多肽和小分子的最佳解決方案。

 

EMR 對Exactive Plus 系統的升級體現在：

擴展的質量數范圍m/z 350-20,000；高質量數離子的傳輸效率更高，提升信號強度；改進的HCD 壓力和控制，更容易優化實驗條件；能夠捕捉更短時間的時域信號，提高信噪比。

 

圖1 配備Advion Inc. TriVersa NanoMate^® 芯片電噴霧離子源的Exactive Plus EMR

 

使用單抗分子量測試標準品（Waters 186006552），按Micro Bio-Spin® Columns（BIO-RAD）標準操作步驟將單抗溶液體系置換為100mM NH₄Ac，單抗樣品濃度為10μM。

 

 

 

質譜條件
儀器	Exactive Plus EMR Orbitrap MS system（圖1）
Mass Range	350-20000
Resolution	8750, 17500, 35000, 70000, 140000
Micro scans	10
Insource CID energy（eV）	100-200，根據具體實驗條件分別優化
S-lens level（%）	200
Trapping gas pressure setting factor	3
Spectra average	100

 

使用Protein Deconvolution 2.0SP2進行去卷積分析。

 

對于單抗標準品分子量測試，分別采用不同分辨率（8750,17500,35000,70000,140000）測定其在非變性條件下的分子量（圖2）。

 

Exactive Plus EMR總共具有五檔不同的分辨率，供不同分析目的使用。從上圖中不難看出，首先，由于在非變性狀態下蛋白質樣品更不易帶電，與變性條件下相比，150kDa的單克隆抗體出峰在m/z 5000-8000的范圍內，明顯向高質量端移動。Exactive Plus EMR的m/z上限拓展至20000，可輕松勝任非變性條件下單克隆抗體乃至其多聚體的分析需求。其次，即使在最低分辨率下，仍能采集到高信噪比、基線干凈的譜圖，證明了Orbitrap系統所具有的高靈敏度、高質量精度和高穩定性等優點可以生成高質量、高可信度的原始數據。

 

從圖3中可以看出，當使用最低一檔分辨率（8750）時，單克隆抗體的不同糖型之間無法得到分離，通過解卷積結果也可以發現，其結果與標準分子量有較大差距。這證明當分辨率不夠高時，由于測量精確度不夠，造成解卷積結果與標準分子量差距較大。

 

 

圖2 在不同分辨率下測定單抗分子量測試標準品分子量

 

 

圖3 8750分辨率下單抗標準品分子量測定結果

 

 

圖4 35000分辨率下單抗分子量測試標準品分子量測定結果

 

圖4為35000分辨率下對單抗標準品分子量測定的原始譜圖和解卷積譜圖。從原始譜圖中可以看出，單克隆抗體的不同糖型得到了完全基線分離，譜圖干凈、信噪比高。觀察解卷積后的譜圖可以發現，當測量精確度提高時，樣品的質量精度得到了飛躍性的提高。

 

圖5展示了在140000分辨率下對單抗標準品分子量測定的結果。從圖中可以看出，當采用最高分辨率——140000進行分析時，許多在低分辨率下無法得到的峰都得到了解析。在保持高分辨率的同時，Exactive Plus EMR仍具有極高的靈敏度和質量精度，對于150kDa的完整單克隆抗體，主要糖型的質量偏差均在1.5Da之內（外標校正）。

 

圖5 140000分辨率下單抗分子量測試標準品分子量測定結果

 

在本實驗中，我們使用Exactive Plus EMR高分辨質譜對非變性狀態下的單克隆抗體進行了分子量測定。結果表明，Orbitrap系統可以實現單抗不同糖型之間的基線分離，在保持高靈敏度、高質量精度的同時獲得雜質與樣品峰清晰基線分離、高信噪比的譜圖。

 

從實驗結果中還可觀察到，基于Orbitrap技術的Exactive Plus EMR高分辨質譜提供了多檔分辨率供選擇，當分辨率過低不足以將不同修飾的質譜峰分開時，可通過提高分辨率將其分開，從而獲得高精度、高可信度的結果。

 

基于Exactive Plus EMR的非變性質譜技術不僅可以用于單克隆抗體分子量測定，還可用于非變性狀態下ADC藥物的藥-抗體比率（DAR）測定、抗原-抗體結合比測定及蛋白復合物分析等，具有廣闊的應用前景。

 

1 Heck, A. J. Nat. Methods 2008, 5, 927-933.

2 Beck, A. et al., TrAC2013, 48, 81-95.

3 Beck, A. et al., Anal. Chem. 2013, 85, 715-36.