新藥研發動力

21世紀質譜技術驅動藥物代謝研究前進

作者：黃瑩瑩博士，市場戰略專家，賽默飛世爾科技，圣何塞，加利福尼亞，美國

在藥物研發的歷史上，信息是無與倫比的動力。對一個藥物研發公司來說，盡可能早的掌握藥物研發過程中候選藥物代謝過程的具體信息是至關重要的。它可以節省時間、寶貴的資源，以及最大化投資收益率。成功的候選藥物的最后選擇，很大程度上依賴于體內和體外的藥物代謝研究。

質譜是藥物代謝研究中用到的一個關鍵性的分析工具，因為它可以識別代謝物，確定代謝發生的位點。液相色譜與質譜聯用(LC-MS/MS)法因為靈敏度高和分析復雜混合物的能力，已經成為代謝鑒定的特別技術。但是，在分析靈敏度與過去數十年相比極大改進的同時，非常復雜的生物基質存在的情形下檢測和鑒定代謝物仍然是一種挑戰。

質譜的硬件和軟件上的新發展正在幫助解決正在進行的這種挑戰。例如，將Orbitrap™ 質量分析器串聯到線性離子阱質譜上，就可以簡化代謝鑒定過程，使之更快，更靈敏，更精確(分辨率超過100K，質量精度大于3ppm)，并且可以揭示豐富的結構信息。有了高分辨和精確的質量數據后，研究人員可以從背景的基質離子中解決和識別代謝物的峰。新的數據處理技術，比如質量虧損過濾，可以用于去除基質相關的大量的背景離子，縮小假陽性的數目，提供更可信的結果。

本指南描述了創新性的質譜和質量虧損過渡軟件的結合，如何導致代謝物鑒定更快更精確。

質量虧損過濾幫助分離潛在的候選藥物

高分辨質譜能夠應用數據采集后的數據精煉技術，這個技術在標稱分辨率的儀器上是不可能實現的。其中之一就是質量虧損過濾(MDF)，在凈化代謝物譜圖和過濾大量的背景離子從而改善信噪比方面取得了顯著的成效。

“質量虧損”指的是一個元素（或者一個化合物）的精確質量數和它最接近的整數值（見表1）之間的差異。代謝物的質量虧損通常位于相當窄的范圍內�；�于母體藥物的分子量，研究人員可以估計這些代謝物的分子量范圍和質量虧損落在什么區間。質量虧損過濾用于排除落在期望的范圍之外的所有離子。

這個數據縮減技術允許用戶單單注意潛在的候選藥物代謝物分析，它是用高分辨質量數據獲得小的更精煉的數據集的最強大最精細的方式之一。這種方法也可以擴展 于多重質量虧損過濾(MMDFs)，也就是在一個相對較寬的質量虧損范圍內用幾個過濾器來鑒定感興趣的代謝物。

用質譜鑒定代謝物

代謝物鑒定通過將多重質量虧損過濾應用于LTQ Orbitrap XL™組合質譜儀（賽默飛世爾科技）的數據收集過程來執行。該質譜儀的特點是執行高能碰撞解離(HCD)進行裂解反應的碰撞室(圖1)。高能碰撞解離能夠提供線性離子阱中碰撞誘導解離之外的輔助裂解算途徑。離子離開C-trap（見圖1）后被加速，然后在充滿氮氣的HCD碰撞室裂解。因此而產生的碎片返回到C-trap，然后在儀器的質量分析器中被檢測。這個技術產生豐富的“類似三重四極桿”裂解方式，包括對說明代謝物結構非常有用的低m/z質量范圍的碎片。

圖1：LTQ Orbitrap XL示意圖，突出C-trap后面的HCD碰撞室。

伊立替康是一種被認可使用的治療結腸和直腸癌的藥物。用老鼠的肝臟細胞孵育伊立替康樣品，再用帶高能碰撞解離功能的LTQ Orbitrap XL儀器分析。收集潛在代謝物的碰撞誘導解離(CID)和高能碰撞誘導質譜圖，并且用多重質量虧損過濾處理原始數據。

材料和方法

樣品：用一個雄性老鼠和一個雌性老鼠混合的肝細胞進行孵育實驗，細胞密度為50萬個/mL，伊立替康在最終1mL的孵育液中的濃度為10 µM。溶液震搖過夜，用干冰淬滅，然后加入200µL冷凍的乙腈，將溶液渦旋混合，離心。從1mL上清液中取出10 µL，進LC-MS/MS系統進行分析。

高效液相色譜:  Thermo Scientific Accela高速液相；

色譜柱: Thermo Scientific Hypersil GOLD，1×100 mm, 1.9 µm粒徑；

質譜: Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL，帶HCD碰撞室。 

結果

圖2：伊立替康的MS/MS質譜圖：(a) 線性離子阱采集的碰撞誘導解離MS/MS質譜圖；(b) Orbitrap采集的高能碰撞解離MS/MS質譜圖。

表1.從老鼠肝細胞孵化的10μM伊立替康樣品中鑒別出來的假定代謝物。用不同顏色加亮的部份已經用不同的質量虧損過濾器過濾了。 

使用高能碰撞解離和碰撞誘導解離(表2)的同時，結合使用多重質量虧損過濾，可以從孵育樣品中鑒別15種伊立替康代謝物，精確度優于3ppm (表1)。所有的15種代謝物的峰面積均小于母體化合物的1%，并且隱藏在原始的色譜圖中(圖3a)。 應用單次質量虧損過濾后，豐度最高的代謝物的峰變成可見了(圖3b)。然而，目前跟代謝物無關的背景基質離子產生的峰仍然很突出。這是為了僅僅使用一次質量虧損過濾來俘獲所有的代謝物，使用了相對較寬的質量虧損范圍。因此，一部份背景離子在單次質量虧損過濾后仍然會殘留下來。

接下來，四個不同的質量虧損過濾器用Thermo Scientific MetWorks軟件包應用原始數據中。這個軟件包可同時應用六個質量虧損過濾器。處理后的色譜圖更干凈(圖3c)。

圖3：老鼠肝細胞孵育10mM伊立替康的基峰色譜圖：(a)原始的；(b)單次質量虧損過濾；(c)多重質量虧損過濾(MMDF)。

圖4：8.45分鐘位置的全掃描質譜圖：(a)原始的；(b)單次質量虧損過濾；(c)多重質量虧損過濾(MMDF)。 

圖4進一步闡明了質量虧損過濾后全掃描質譜圖如何變化的。m/z 603.2805的峰是在8.45分鐘流出的一個羥基化代謝產物(M3)。在原始的全掃描質譜圖中，背景離子占絕對優勢，M3僅僅只有小于15%的相對豐度(圖4a)。經過單次質量虧損過濾后，M3峰變成了基峰。然而，仍然有許多背景峰殘存在譜圖中(圖4b)。經過多重質量虧損過濾后，譜圖中僅有M3峰和痕量的母峰存在，與此同時，幾乎所有的背景離子消失了(圖4c)。

高能碰撞解離和碰撞誘導解離的結合使用，提供了全面的裂解信息。多重質量虧損過濾提供了比單次質量虧損過濾更高的背景鑒別能力，能夠鑒別出峰面積小于母體藥物峰面積1%的代謝物峰。 

展望

最近幾年，質譜經歷了長足的發展，正在締造藥物研發公司執行代謝物鑒定研究的美好前景。制藥公司期望儀器能夠實現盡可能少的用戶干涉，提供高能量的分析和高質量的數據。隨著進程的瓶頸轉移到數據處理方面，數據縮減技術必須繼續改進以適應這種挑戰。