細胞沉默調節蛋白1 （SIRT1）活性熒光定量檢測試劑盒（中文版）

 

主要用途

 

YIJI 細胞沉默調節蛋白1 （SIRT1）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針氨甲基香豆素標記人工合成的乙酰化p53多肽底物，經過SIRT1脫乙酰基后，被位點特異性氨基肽酶水解，釋放黃色對硝基苯胺，即采用熒光法來測定細胞裂解萃取樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、核蛋白樣品、部分或完全純化酶樣品中SIRT1的活性定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

人體組蛋白脫乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家屬分成三類共20多個蛋白：種類I（class I）與酵母Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于細胞核中；種類II（class II）與酵母Hda1蛋白同源，包括HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于細胞核和細胞漿里；上述兩大種類的蛋白分子催化結構域含有鋅，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。種類III（class III）為NAD⁺輔助因子必需，又稱為sirtuins，與酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，為曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型賴氨酸脫乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化賴氨酸脫乙酰基反應，以及由NAD⁺和乙酰（acetyl）基團轉化產生的煙酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于細胞核內，與酵母Sir2同源性最高。其功能在于調節p53活性和抑制細胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379至382氨基酸位點）多肽底物Ac-Arg—His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切離的功能，首先使用熒光染料氨甲基香豆素（aminomethylcoumarin；AMC）來標記乙酰化p53多肽底物，其次進行脫乙酰化，最后底物進一步在氨基肽酶的催化酶解，釋放出具有強烈熒光的7-氨-4甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin；AMC）（激發波長350-360nm；散發波長450-465nm），由此來定量測定沉默調節蛋白1的活性。其反應系統為：

 

產品內容

 

YIJI 裂解液（Reagent A）  毫升

YIJI 分離液（Reagent B）  毫升

YIJI 清理液（Reagent C）  毫升

YIJI 萃取液（Reagent D）  毫升

YIJI 緩沖液（Reagent E）       毫升

YIJI 底物液（Reagent F）  微升

YIJI 終止液（Reagent G）  微升

YIJI 酶解液（Reagent H）       微升

YIJI 補充液（Reagent I）       微升

YIJI 標準液（Reagent J）   微升

產品說明書   1份

 

保存方式

 

保存YIJI緩沖液（Reagent E）、YIJI底物液（Reagent F）、YIJI終止液（Reagent G）、YIJI酶解液（Reagent H）和YIJI標準液（Reagent J）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent F）和YIJI 標準液（Reagent J）避免光照，有效保證6月

 

用戶自備

 

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：用于清洗細胞樣品

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

（微型）臺式離心機：用于細胞預處理

培養箱：用于反應物孵育

酶標板或比色皿：用于反應和熒光分析的容器

熒光酶標儀或熒光分光光度儀：用于熒光分析

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進行下列操作。

 

一、樣品準備

 

• 準備好75cm²細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁷細胞）
• 小心抽去培養液
• 小心加入10毫升用戶自備的磷酸鹽緩沖溶液（PBS），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI 裂解液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管 
• 強力渦旋震蕩10秒
• 置于冰槽里孵育15分鐘
• 加入xx毫升預冷的YIJI 分離液（Reagent B），混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升預冷的YIJI 清理液（Reagent C）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1300g
• 小心抽去上清液
• 小心加入xx微升預冷的YIJI萃取液（Reagent D），混勻
• 轉移到新的預冷的1.5毫升離心管
• 超聲處理30秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 準備好待測樣品（例如核蛋白或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設定好熒光酶標儀或熒光分光光度儀（溫度為30℃）：激發波長350-360nm；散發波長450-465nm 
• YIJI 緩沖液（Reagent E）置于室溫下均衡溫度
• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入xx微升YIJI緩沖液（Reagent E）到1至5號管
• 移取xx微升YIJI標準液（Reagent J）到1號管，混勻
• 小心移取xx微升1號管稀釋的YIJI標準液（Reagent J）到2號管，混勻
• 小心移取xx微升2號管稀釋的YIJI標準液（Reagent J）到3號管，混勻
• 小心移取xx微升3號管稀釋的YIJI標準液（Reagent J）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

管號	YIJI緩沖液（Reagent E）	YIJI標準液（Reagent J）	標準氨甲基香豆素濃度
1	xx微升	xx微升	xx微摩爾/升
2	xx微升	xx微升1號管	xx微摩爾/升
3	xx微升	xx微升2號管	xx微摩爾/升
4	xx微升	xx微升3號管	xx微摩爾/升
5	xx微升	0	0

 

三、活性測定

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：標準樣品1至5管
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent E）到相應孔中
• 分別加入xx微升上述配制的YIJI標準液（Reagent J） 
• 輕輕搖動96孔酶標板30秒
• 即刻放進熒光酶標儀或轉移到100微升比色皿，在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）讀數
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對熒光單位（RFU）；橫座標（X軸）為標準氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

四、活性測定

 

• 在96孔酶標板上做好相應標記：背景空對照和待測樣品
• 分別移取xx微升YIJI 緩沖液（Reagent E）到相應孔中
• 分別加入xx微升YIJI 底物液（Reagent F）
• 分別加入xx微升YIJI 補充液（Reagent I）或待測樣品（50微克核蛋白或200微克細胞裂解萃取液總蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動96孔酶標板30秒
• 放進30℃培養箱里，孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入xx微升YIJI 終止液（Reagent G）
• 分別加入xx微升YIJI 酶解液（Reagent H）
• 輕輕搖動96孔酶標板30秒
• 在30℃培養箱里，孵育30分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀或轉移到100微升比色皿，在熒光分光光度儀里檢測：獲得相對熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應氨甲基香豆素濃度（微摩爾/升）

 

• 計算樣品活性

 

方法一：RFU直接法

 

 

方法二：標準氨甲基香豆素濃度測算法

  

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 系統操作過程中，標準測定只需1次
• 樣品須澄清，至關重要
• 樣品處理時，避免使用蛋白酶抑制劑、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 測定值由低到高變化；測定持續60分鐘
• 測定值熒光讀數越高，表明酶活性越高
• 熒光測定后，比色皿須清洗徹底
• 待測樣本為核蛋白樣品，其蛋白濃度為50微克/20微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供 YIJI  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒YJ30030.1）
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 樣品活性計算根據用戶要求，選擇直接法或測算法；如果選擇直接法，可以不必測定標準樣品
• 沉默調節蛋白1單位活性定義為：在30℃，pH 8.0條件下，每分鐘內能夠釋放1納摩爾氨甲基香豆素所需的酶量作為一個活性單位
• 本公司提供系列組蛋白脫乙酰基酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

 

 

使用承諾

 

上海一基秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。

 

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