GENMED細菌β-半乳糖苷酶活性化學發光法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

GENMED細菌β-半乳糖苷酶活性化學發光法定量檢測試劑是一種旨在使用化學方法，快速有效地裂解細菌細胞，通過高速離心，獲得澄清細菌裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應體系里，以人工合成的二惡二酮類化合物作為發光底物，水解所產生的發光產物，通過發光探測儀（Luminometer）測定其相對冷光單位（RLU）的變化，以此進行測算酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于基因組學、蛋白質組學和其它分子生物學研究。其適用于活體細菌內源性或外源性β-半乳糖苷酶活性分析。產品即到即用，性能穩定，參數優化，操作簡便、高度敏感。

 

技術背景

 

大腸桿菌的標志基因Lac Z編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可從乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常穩定，對蛋白水解降解作用抗性強，且容易測試。因此β-半乳糖苷酶成為目前最常用的報告基因，以評價載體轉染的效果。甲氧基二惡二酮氯代金剛烷苯基吡喃半乳糖苷（3- (4-methoxyspiro [1, 2-dioxetane-3, 2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7]-decan]-4-yl-phenyl -ß-D-galacto pyranoside），是一種二惡二酮（dioxetane）類發光底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶（pH7.8）的催化下，去糖基化后，產生二惡二酮，進而在多聚苯甲基乙烷乙烯基苯甲氯化銨和熒光素鈉（poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride and sodium fluorescein）的啟動反應作用下，同時pH調整到12，由此二惡二酮分解，發出冷光，在冷光儀（475nm波長），檢測發光信號，來測定β-半乳糖苷酶的活性。其發光產物半衰期為10分鐘，檢測敏感度可達20飛克（fg）。

 

產品內容

 

GENMED裂解液（Reagent A）     毫升

GENMED活性液（Reagent B）   微升

GENMED稀釋液（Reagent C）   微升

GENMED反應液（Reagent D）   微升

GENMED堿性液（Reagent E）   毫升

GENMED啟動液（Reagent F）   微升

GENMED陰性液（Reagent G）   毫升

產品說明書     1份

 

保存方式

 

保存GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent B）、GENMED反應液（Reagent D）和GENMED啟動液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED反應液（Reagent D）和GENMED啟動液（Reagent F）避免光照；GENMED堿性液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

 

 

用戶自備

 

β-半乳糖苷酶標準樣（GMS60003.2.2）：用于建立β-半乳糖苷酶標準曲線

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

恒溫水槽或培養箱：用于反應物孵育

冷光儀：用于樣品冷光檢測

 

實驗步驟

 

實驗開始前，開啟分光光度儀預熱，設置波長420nm；開啟恒溫水槽，設置溫度為37℃。同時從－20℃冰箱里取出GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent B）和GENMED反應液（Reagent D）置于冰槽里融化；GENMED反應液（Reagent D）避免光照。然后進行下列操作：

 

• 樣品準備

 

• 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 移取500微升過夜培養的細菌到15毫升錐形離心管
• 加入用戶自備的10毫升新鮮培養液和誘導劑
• 放進37℃搖床孵育2小時，速度為220RPM（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升）
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 加入xx微升GENMED活性液（Reagent B）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

 

• 測定準備

 

• 從-70℃取出上述制備的待測樣品，置于冰槽里 
• GENMED反應液（Reagent D）和GENMED啟動液（Reagent F）嚴格注意避光
• 設定好化學發光儀：溫度為30℃預熱和運行程序（清洗步驟等）：整合5秒，并置零 
• 然后關掉實驗室的燈光

 

 

• 活性檢測

 

檢測開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置入冰槽里融化；然后移出xx微升GENMED稀釋液（Reagent C）到新的1.5毫升離心管，加入xx微升GENMED反應液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為GENMED反應工作液，放在暗室里。同時移出xx微升GENMED堿性液（Reagent E）到另一新的1.5毫升離心管，加入xx微升GENMED啟動液（Reagent F），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為GENMED啟動工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

 

• 準備1個黑色96孔酶標板，并做好標記：包括背景對照和待測樣品
• 分別加入xx微升GENMED反應工作液到所有測試孔里
• 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent G）到背景對照孔里
• 加入5微升待測樣品（50微克細菌裂解懸液蛋白）到待測樣品孔里
• 輕輕搖動酶標板，混勻
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 分別加入xx微升GENMED啟動工作液到所有測試孔里
• 輕輕搖動酶標板，混勻
• 室溫下靜置10秒，嚴格避免光照
• 即刻放進冷光儀檢測：5秒整合檢測
• 獲得相對發光單位（Relative Light Unit；RLU）

 

• 樣品活性分析

五、樣品β-半乳糖苷酶實際活性單位計算（建議使用GENMED β-半乳糖苷酶標準曲線化學發光法測定試劑盒－GMS60003.2.2）

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 建議使用核內表達的載體代替胞內表達的載體轉染或感染細胞或組織
• 本產品的各項參數達到最優化
• 操作時，須戴手套
• GENMED反應液（Reagent D）和GENMED啟動液（Reagent F）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進行，避免反復凍融
• 測讀的所有步驟均須在暗室里進行
• 系統操作過程中，背景測定只需1次
• 用戶可以測定細胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需；建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量檢測試劑盒（GMS30030.1）
• 加入GENMED啟動工作液10秒后，即刻進行冷光測定
• 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數器）替代，但敏感性較低
• 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 相對發光讀數RLU（Relative Light Unit）越高，表明酶活性越高
• 測定后，專用測定杯須清洗徹底
• 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/5微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量 
• 用戶可以使用β-半乳糖苷酶構建標準曲線，進行樣品酶活性單位檢測或使用GENMED β-半乳糖苷酶標準曲線化學發光法測定試劑盒－GMS60003.2.2
• 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

使用承諾

上海一基秉著“信譽至上、客戶滿意、質量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優質產品和服務。用戶收到貨后，應按照產品說明書上的規定妥善保管并在有效期內使用。我們的產品在銷售前已作嚴格的質量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內若發現確屬本產品的質量問題，請立即以書面形式（實驗報告）與本公司聯系，并將該產品退回，經檢驗確系產品質量所致，本公司負責更換產品。如系使用者錯誤操作所致，本公司不承擔由此造成的損失。

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