關鍵詞：游離藥物濃度，F(xiàn)ree Concentration，生物樣本前處理，生物樣品前處理，平衡透析法，equilibrium dialysis（ED），超濾法，Ultra-filtration（UF），快速平衡透析裝置，RED，血漿蛋白結合，Plasma Protein Binding(PPB)

游離藥物濃度（Free Concentration）是指生物樣本（如血漿、血清、組織液等）中未與蛋白質(zhì)或其他大分子結合的游離態(tài)藥物、激素、代謝物或其他小分子分析物的濃度。由于許多生物活性物質(zhì)在體內(nèi)會與蛋白質(zhì)（如白蛋白、α₁-酸性糖蛋白、免疫球蛋白等）結合，只有游離部分才能發(fā)揮藥理或生理活性，因此測定游離藥物濃度（Free Concentration）在藥代動力學（PK）、藥效學（PD）、臨床監(jiān)測和生物分析樣本前處理過程中具有重要意義。

一、游離濃度的前處理技術
在生物樣本（如血液、尿液、組織等）中測定游離（未結合）藥物、激素或其他分析物的濃度時，生物樣本前處理步驟需確保目標物質(zhì)的游離狀態(tài)不被破壞，同時去除干擾物質(zhì)。目前的游離藥物濃度分析生物樣品前處理技術有平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）、超速離心法（Ultracentrifugation，UC）、凝膠過濾/尺寸排阻色譜（Size-Exclusion Chromatography, SEC）、固相萃取或免疫親和純化和化學或酶解處理（結合型釋放后檢測），但常用的是平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC），其中平衡透析法更是游離藥物濃度生物樣品前處理技術的金標準。

1.1 平衡透析法
平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）是測定生物樣本（如血漿、血清）中游離藥物、激素或代謝物濃度的金標準方法，常用于血漿蛋白結合試驗（Plasma Protein Binding, PPB），其核心原理是利用半透膜使游離小分子在樣本與緩沖液之間達到平衡，而大分子結合物（如蛋白結合型藥物）因無法透過膜被分離。

【試驗步驟】
1、樣本準備：血漿、血清、腦脊液或其它基質(zhì)
2、透析裝置：不銹鋼特氟龍板平衡透析裝置（HTD）或快速平衡透析裝置（RED）
3、膜選擇：纖維素膜
4、加樣：供體室加入含藥基質(zhì)，受體室加入PBS
5、孵育：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~24小時，根據(jù)裝置決定孵育時間
6、終止與收集：分別從供體室和受體室取一定體積的溶液，用LC-MS/MS、HPLC或免疫分析法檢測濃度。

由上可知，平衡透析法的關鍵步驟在于裝置、膜的選擇、平衡時間的優(yōu)化等三個方面。IPHASE作為體外研究生物試劑的引領者，為提供更好的服務，開發(fā)了普通平衡透析裝置（HTD）和快速平衡透析裝置（RED）兩種，均配以纖維素膜，以期滿足不同客戶的多種需求。它們在原理上相似，但在實驗設計、操作效率、適用性等方面存在差異，以下為兩者詳細對比：

參數(shù)	平衡透析（HTD）	快速平衡透析（RED）
平衡時間	12~16小時	4-6小時
最低樣本量	100~200 uL	50~100 uL
準確性	金標準	金標準
適用結合率范圍	低至高（游離濃度0.1%~99%）	中至高（游離濃度＞0.5%更可靠）
操作便捷性	需手動組裝，步驟較多	商業(yè)化試劑盒，操作簡便
高通量支持	是（96孔板）	是（48孔板）

 
1.2 超濾法
超濾法（Ultrafiltration, UF）的核心原理是通過離心力驅(qū)動小分子游離分析物通過超濾膜，而大分子蛋白及結合物被截留。以下是超濾法的全面解析，包括原理、步驟、優(yōu)缺點、優(yōu)化策略及與平衡透析的對比。

【試驗步驟】
1、樣本類型：血漿或血清
2、樣本預處理：3000×g, 10分鐘，去除細胞碎片或纖維蛋白
3、加樣：將100-200 μL血漿加入超濾離心管
4、離心：37℃ 2000-3000×g, 30分鐘（需優(yōu)化轉(zhuǎn)速和時間，避免膜堵塞或結合物解離）
5、收集濾液：取濾液（通常10-50 μL）用于檢測（LC-MS/MS、HPLC等）

作為快速經(jīng)濟測定游離濃度的方法之一，超濾法具有快速高效、使用樣本量少、及操作簡便等優(yōu)點，但同樣由于其裝置的影響，超濾法存在著膜吸附、剪切力干擾及高結合藥物靈敏度受限等不可忽視的缺點。因此，客戶可根據(jù)自己的試驗需求選擇前處理技術，若需快速篩查或樣本量有限，可優(yōu)先選擇超濾法；若需高精度數(shù)據(jù)，則應選擇平衡透析法。
1.3 超速離心法
超速離心法(Ultracentrifugation, UC)是一種基于物理分離的技術，通過極高的離心力（通常 >100,000×g）將生物樣本中的游離分析物與結合型分析物（如蛋白結合物）分離。該方法適用于血漿、血清、腦脊液等樣本中游離藥物、激素或代謝物的測定。其原理是依據(jù)在超高速離心條件下，由于分子大小和密度的差異，大分子（如蛋白質(zhì)、蛋白結合型分析物）因分子量大、密度高而沉降到管底，而游離的小分子（未結合）則保留在上清液中。

【試驗步驟】
1、樣本類型：血清、血漿、組織樣本
2、離心速度：100,000–150,000×g，速度過低可能導致結合物沉降不完全
3、離心時間：30min-2小時，時間過長可能導致游離分子吸附或降解
4、溫度：4℃（推薦）或室溫，低溫減少蛋白變性和結合物解離
5、離心管類型：聚碳酸酯或超離心專用管，避免使用易吸附分析物的材質(zhì)
6、收集濾液：小心吸取上清液（避免擾動沉淀），用于后續(xù)分析（如HPLC、LC-MS/MS）；
若需測定結合型分析物，可溶解沉淀（如用緩沖液或有機溶劑）后檢測。

超速離心法(Ultracentrifugation, UC)由于其不引入抗體、吸附劑等物質(zhì)，具有無外源干擾、適用性強和樣本兼容性強等3種優(yōu)點，但由于其通過高速離心進行分離，亦存在潛在結合物解離、樣本損傷多及硬件設施不滿足試驗等問題。因此，若實驗條件允許，可結合超濾或平衡透析進行方法驗證，確保數(shù)據(jù)可靠性。



綜上所述，常見的游離濃度樣本分析前處理技術包括平衡透析法（equilibrium dialysis，ED）、超濾法（Ultra-filtration，UF）和超速離心法（Ultracentrifugation，UC），它們有各自的適用范圍和優(yōu)缺點。因此，客戶應結合實際情況以選擇合適的方法進行游離濃度的獲取。

參數(shù)	平衡透析（ED）	超濾（UF）	超速離心（UC）
分離原理	擴散平衡	膜截留+離心力驅(qū)動	沉降速度差異
速度	慢（小時級）	快（分鐘級）	中等（1-2小時）
是否干擾平衡	幾乎不干擾	可能干擾（濃差極化）	可能干擾（高壓/剪切力）
樣品量	微量（50-200 uL）	中小量（100-500 uL）	中大量（0.5-2 mL）
適用場景	科研（結合常數(shù)測定）	臨床（快速檢測）	特殊體系（脂蛋白、納米顆粒）
成本	低（透析膜成本低）	中（超濾管一次性）	高（設備昂貴）

綜上所述，游離濃度的生物樣本分析前處理主要有平衡透析法、超濾法和超速離心法等三種方法，作為體外研究生物試劑引領者，IPHASE可以給平衡透析前處理提供血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置、一次性快速平衡透析板、可重復使用快速平衡透析板、快速平衡透析插件、平衡透析膜、血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置封口膜、血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置底座、特氟龍板和超濾管等多類產(chǎn)品。

名稱	規(guī)格
血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置	24/48/96孔
一次性快速平衡透析板	1 Plate,48 Wells
可重復使用快速平衡透析板	1 Plate,48 Wells
快速平衡透析插件10個,12-14kDa	10 Inserts,12-14kDa
快速平衡透析插件10個,8kDa	10 Inserts,8kDa
快速平衡透析插件50個,12-14kDa	50 Inserts,12-14kDa
快速平衡透析插件50個,8kDa	50 Inserts,8kDa
快速平衡透析裝置48插管	48 Inserts,12-14kDa
快速平衡透析裝置48插管	48 Inserts,8kDa
平衡透析膜	3.5kd，12-14kd，25kd，50kd
血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置封口膜	100 Sheets
特氟龍板	96孔-9塊，24孔-5塊，48孔-7塊
超濾管	0.5mL 10 kd/50支
血漿蛋白結合試驗平衡透析裝置底座	1個

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