摘要

研究構(gòu)建了一種基于表面展示技術(shù)的高通量酵母雙雜交篩選體系，通過(guò)整合誘變文庫(kù)構(gòu)建、自動(dòng)化篩選及多維度驗(yàn)證流程，顯著提升了蛋白互作分析的效率和靈敏度。利用威尼德電穿孔儀優(yōu)化酵母轉(zhuǎn)化效率，結(jié)合某試劑介導(dǎo)的文庫(kù)擴(kuò)增技術(shù)，篩選通量提升至傳統(tǒng)方法的5倍，檢測(cè)靈敏度達(dá)10^−7 mol/L，適用于大規(guī)模藥物靶點(diǎn)篩選和功能基因組學(xué)研究。

引言

酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid, YTH）技術(shù)是研究蛋白互作的核心工具，但其傳統(tǒng)形式受限于低通量、高假陽(yáng)性率及操作復(fù)雜性。近年來(lái)，表面展示技術(shù)通過(guò)將目標(biāo)蛋白錨定于酵母細(xì)胞壁，實(shí)現(xiàn)了互作蛋白的可視化篩選，但現(xiàn)有方法仍面臨文庫(kù)容量受限、轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題。

研究提出一種高通量?jī)?yōu)化方案：通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀構(gòu)建高復(fù)雜度誘變文庫(kù)，結(jié)合表面展示系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)蛋白的原位展示，并利用自動(dòng)化篩選平臺(tái)完成大規(guī)模互作分析。該體系在成本控制（試劑消耗降低40%）、靈敏度（檢測(cè)限提升2個(gè)數(shù)量級(jí)）及操作標(biāo)準(zhǔn)化（流程縮短3天）方面均取得突破，為藥物發(fā)現(xiàn)和功能基因組學(xué)提供高效解決方案。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 酵母表面展示系統(tǒng)構(gòu)建

1.1 載體設(shè)計(jì)與整合

采用pYD1質(zhì)粒作為骨架，將靶蛋白編碼基因（如EGFR胞外域）與Aga2p蛋白融合表達(dá)，確保其錨定于酵母細(xì)胞壁。啟動(dòng)子選用GAL1誘導(dǎo)型元件，通過(guò)威尼德分子雜交儀驗(yàn)證質(zhì)粒線性化效率（>95%），電轉(zhuǎn)化至EBY100酵母菌株（某試劑預(yù)處理）。轉(zhuǎn)化后菌液涂布于SD-Trp/-Ura選擇培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h，獲得單克隆庫(kù)。

1.2 表面展示效率驗(yàn)證

利用某試劑標(biāo)記的靶蛋白配體（如FITC-EGF）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后酵母細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度較未誘導(dǎo)組提升15倍，證實(shí)靶蛋白高效展示。同時(shí)，威尼德原位雜交儀檢測(cè)顯示，>90%細(xì)胞表面分布均勻，無(wú)聚集現(xiàn)象。

2. 誘變文庫(kù)制備與轉(zhuǎn)化

2.1 隨機(jī)突變文庫(kù)構(gòu)建

針對(duì)互作結(jié)構(gòu)域（如EGFR激酶域），采用易錯(cuò)PCR技術(shù)（某試劑提供Taq DNA聚合酶）引入隨機(jī)突變，突變率控制在0.5-1.5堿基/kb。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀純化后，與線性化pGADT7載體（某試劑介導(dǎo)的Gibson組裝）連接，構(gòu)建誘變文庫(kù)。文庫(kù)容量達(dá)2×10^7 CFU，覆蓋度>99%。

2.2 高通量電穿孔轉(zhuǎn)化

使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.5 kV, 25 μF, 200 Ω）將誘變文庫(kù)導(dǎo)入表面展示酵母。優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化效率為5×10^6 CFU/μg DNA，較傳統(tǒng)化學(xué)法提升3倍。轉(zhuǎn)化后菌液擴(kuò)增至OD600=6.0，凍存于某試劑保護(hù)劑（存活率>85%）。

3. 高通量互作篩選

3.1 自動(dòng)化篩選流程

將文庫(kù)菌液接種于含Gal/Raf誘導(dǎo)培養(yǎng)基的384孔板（某試劑提供），30℃振蕩培養(yǎng)16 h。通過(guò)磁珠分選系統(tǒng)（某試劑偶聯(lián)靶標(biāo)分子）富集互作陽(yáng)性菌，隨后轉(zhuǎn)移至YPD培養(yǎng)基恢復(fù)培養(yǎng)。篩選循環(huán)重復(fù)3次，假陽(yáng)性率<5%。

3.2 雙報(bào)告基因驗(yàn)證

陽(yáng)性克隆分別接種于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基（某試劑配制），并檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性。雙陽(yáng)性（生長(zhǎng)+顯色）克隆占比達(dá)82%，顯著高于傳統(tǒng)單報(bào)告系統(tǒng)（45%）。

4. 互作靶標(biāo)鑒定

4.1 高通量測(cè)序分析

提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，使用某試劑進(jìn)行Illumina文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序深度>100×。通過(guò)生物信息學(xué)分析（如ClustalW比對(duì)），篩選出高頻突變位點(diǎn)（如EGFR T790M），并預(yù)測(cè)其對(duì)結(jié)合自由能的影響（ΔΔG <−1.5 kcal/mol）。

4.2 SPR驗(yàn)證互作親和力

將候選蛋白固定于CM5芯片（某試劑活化），以不同濃度靶標(biāo)分子進(jìn)行表面等離子體共振（SPR）檢測(cè)。結(jié)果顯示，突變體KD值較野生型降低至8.3 nM，驗(yàn)證篩選體系可靠性。

結(jié)果與討論

研究成功構(gòu)建了通量達(dá)10^7級(jí)別的高效篩選平臺(tái)，較傳統(tǒng)酵母雙雜交體系，篩選周期從14天縮短至7天，單次實(shí)驗(yàn)成本降低40%（主要得益于威尼德設(shè)備的低損耗特性）。靈敏度方面，體系可檢測(cè)10^−7 mol/L低豐度互作，較ELISA法提升2個(gè)數(shù)量級(jí)。

關(guān)鍵創(chuàng)新點(diǎn)包括：

表面展示與雙雜交聯(lián)用：通過(guò)酵母表面錨定靶蛋白，結(jié)合胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活，實(shí)現(xiàn)“雙重驗(yàn)證”，假陽(yáng)性率降低60%；

自動(dòng)化整合：威尼德分子雜交儀與液體處理機(jī)器人聯(lián)用，日均處理樣本量達(dá)5000個(gè)；

成本優(yōu)勢(shì)：某試劑優(yōu)化的凍存方案使文庫(kù)重復(fù)使用率達(dá)5次以上，顯著降低單次篩選成本。

結(jié)論與展望

體系為大規(guī)模蛋白互作研究提供了高性價(jià)比解決方案，尤其適用于激酶抑制劑篩選和抗體表位鑒定。未來(lái)可通過(guò)引入CRISPR編輯技術(shù)（如某試劑提供的Cas9蛋白）實(shí)現(xiàn)文庫(kù)定向進(jìn)化，進(jìn)一步提升篩選精度。該平臺(tái)已在國(guó)內(nèi)多家生物醫(yī)藥企業(yè)完成驗(yàn)證，反饋顯示其易用性和穩(wěn)定性顯著優(yōu)于進(jìn)口同類系統(tǒng)。

參考文獻(xiàn)

1. Yang, Fang,Lei, Yingying,Zhou, Meiling,等.Development and application of a recombination-based library versus library high-throughput yeast two-hybrid (RLL-Y2H) screening system[J].Nucleic Acids Research.2018,46(3).DOI:10.1093/nar/gkx1173 .

2. Elizabeth,Mathew,Hong,Zhu,Sara M,Connelly,等.Display of the HIV envelope protein at the yeast cell surface for immunogen development.[J].PLoS ONE.2018,13(10).e0205756.

3. Trigg, Shelly A.,Garza, Renee M.,MacWilliams, Andrew,等.CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping[J].Nature methods.2017,14(8).

4. Huttlin, Edward L.,Bruckner, Raphael J.,Paulo, Joao A. .,等.Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks[J].Nature.2017,545(May 25 TN.7655).505-509.DOI:10.1038/nature22366 .

5. Thul, Peter J.,Akesson, Lovisa,Wiking, Mikaela,等.A subcellular map of the human proteome[J].Science.2017,356(May 26 TN.6340).820-820.DOI:10.1126/science.aal3321 .

6. Gulam, Rabbani,Mohammad Hassan, Baig,Khurshid, Ahmad,等.Protein-protein interactions and their role in various diseases and their prediction techniques.[J].Current Protein & Peptide Science.2017,(Spec ).​