本文要點：腦側支循環與血腦屏障（BBB）對維持正常腦功能至關重要，受限于現有方法對腦血流微小通路的記錄能力，學界對生理和病理狀態下側支灌注與血腦屏障動態演變的認知仍顯不足。本文報道了一種由小分子染料與牛血清白蛋白構成的高結晶度半導體有機納米探針（命名為4T-BSA），其在第二近紅外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）展現出顯著的活體腦血管成像潛力。該探針在完整小鼠腦中具有卓越的成像穿透深度，信背比（SBR）達6.0，并能在三種典型神經病理生理模型中實現低至50微米級的腦血管空間分辨率。通過可視化血管側支灌注與白蛋白滲漏，4T-BSA納米探針精準識別了與動/靜脈側支血流網絡及血腦屏障破壞相關的腦病理活動。本項研究，基于NIR-II成像的腦側支循環與血腦屏障損傷評估技術，將為神經系統疾病及時干預、神經保護及功能修復等重大醫學挑戰提供廣闊解決方案。

本研究開發了一種高結晶度半導體有機NIR-II納米探針（命名為4T-BSA）。該探針通過修飾CH1055分子的功能基團后，與牛血清白蛋白（BSA）非共價組裝形成新型分子復合物。研究團隊在1350 nm窄波段（NIR-IIa區）開展了系統的體外與活體成像實驗，并與傳統光學及磁共振成像技術進行對比。實驗對象涵蓋腦動脈閉塞（MCAO）、腦靜脈竇血栓（CVST）及戊四氮點燃癲癇等典型神經病理生理模型。多維度證據表明，4T-BSA納米探針能夠高保真記錄生理狀態下深部腦血管血流動力學特征及動靜脈側支循環響應（圖1a–c）。尤為重要的是，得益于對血清白蛋白的高親和力，該探針可在病理條件下（特別是血腦屏障早期滲漏階段）實現無創、精準、實時的血腦屏障微滲漏動態追蹤（圖1d,e）。

圖2. 4T-BSA納米探針的結構和光學特性

將CH1055的四個羧酸基團全部替換為更具負電荷的磺酸基團（命名為4T），然后與牛血清白蛋白（BSA）組裝形成4T-BSA納米探針（圖2a）。4T和4T-BSA納米探針的紫外-可見（UV–vis）光譜在320-1000 nm范圍內顯示出相似的吸收信號。如圖2b所示4T和BSA的自組裝在近紅外二區（NIR-II）成像系統下導致熒光強度顯著增加（圖2b插圖）。4T-BSA納米探針在≈990 nm處有最大熒光發射峰，在808 nm激發下，其發射強度比4T高出110倍以上。在808 nm激發下，4T-BSA在990 nm處的量子產率計算為5.3%。透射電子顯微鏡（TEM）圖像及其對應的粒徑分布直方圖（圖2c）清楚地表明，4T-BSA納米探針具有膠體穩定性，呈球形，平均直徑為5.5±0.6 nm。通過高分辨率透射電子顯微鏡（HR-TEM）仔細測量，在4T-BSA納米探針中可以直接觀察到發育良好的晶格邊緣，其晶面間距約為0.25 nm（圖2d）。元素分布的映射表明存在富含硫的黃色區域，表明小分子4T自組裝到BSA的內部。原子力顯微鏡（AFM）證實，4T-BSA納米探針在水中表現出優異的單分散性，主要直徑位于3-7 nm范圍內（圖2f），與TEM分析一致。通過選擇從1150到1400 nm的連續長通濾波器，發現腦血管在長達1350 nm的更長波長窗口處比在較短波長窗口處更清晰，之后深層血管的信號開始減弱（圖2g）。對腦血管橫截面強度輪廓的進一步量化信噪比（SBR）測量表明，在808 nm激發下，NIR-II成像的最大分辨率在1350 nm長通濾波器（NIR-IIa窗口）（圖2h）。在之后的部分中，除非另有說明，否則成像在NIR-IIa窗口中進行。

圖3. 利用4T-BSA納米探針在不同小鼠模型中對腦血管進行高分辨率NIR-IIa熒光活體成像

為了探究近紅外二區（NIR-II）成像觀察腦循環系統病理生理過程的可行性，分別將4T-BSA和吲哚青綠（ICG）-BSA納米探針以等效劑量（35 nM）通過靜脈注射到三種典型的神經病理生理學小鼠模型中（每組3只）。在808 nm激光照射下，通過完整的頭皮和頭骨，在狹窄的1350-1650 nm成像區域內，對小鼠腦的腦血管系統進行了大視場成像記錄。與ICG-BSA納米探針在NIR-I（<900 nm）區域中無法區分的血管和較低的信噪比（SBR）。形成鮮明對比的是，4T-BSA納米探針在NIR-IIa窗口中的腦血管熒光成像明顯顯示出更高的空間分辨率，無論是在哪種神經病理生理學小鼠模型中。在假NIR-IIa組（圖3a、d）中，通過4T-BSA納米探針拍攝的腦血管造影清晰地顯示了大腦中動脈（MCA）、下腦靜脈、上矢狀竇（SSS）、橫竇、竇匯，以及頭皮和頭骨下的雙側大腦半球中的大量皮質血管和腦微血管。4T-BSA納米探針在NIR-IIa區域中SSS的信噪比（圖3d）計算為6.0±0.1，這明顯高于ICG-BSA在NIR-I窗口中的信噪比（1.7±0.2；P<0.01）。在NIR-IIa區域中成像的SSS的高斯擬合半高全寬（FWHM）估計為702±3.9 µm（圖3g），而通過ICG-BSA納米探針成像的SSS的FWHM增加到1105±8.2 µm。此外，左右大腦中動脈區域選定血管的FWHM分別為206±2.3和149±4.1 µm。

在大腦中動脈閉塞（MCAO）的NIR-IIa組中，4T-BSA納米探針的NIR-II熒光信號在對側大腦半球的右側大腦中動脈（MCA）區域可以明顯觀察到（圖3b、e），而在左側（同側）半球幾乎沒有信號（用白色虛線圈標出）。右側MCA區域選定血管的橫截面強度輪廓的半高全寬（FWHM）被確定為197±7.1 µm，而在左側的鏡像動脈上無法實現這一測量（圖3h），這表明MCA區域存在低灌注。同樣，在腦靜脈竇血栓形成（CVST）的NIR-IIa組中，4T-BSA納米探針可以照亮雙側大腦中動脈區域（圖3f）。左側MCA區域選定血管的FWHM為129±5.2 µm，信噪比（SBR）高達5.2±0.1（圖3i），而在上矢狀竇（SSS）區域幾乎沒有監測到熒光信號。因此，NIR-IIa成像能夠準確定位CVST模型中的血栓位置。

圖4. 4T-BSA納米探針NIR-IIa活體成像定量分析不同神經病理生理模型小鼠血流動力學腦灌注

為了研究局部腦血流，研究人員分別通過尾靜脈注射將35 nM的4T-BSA納米探針注入假手術（sham）、大腦中動脈閉塞（MCAO）和腦靜脈竇血栓形成（CVST）模型的C57BL/6小鼠體內。通過時間序列的NIR-IIa成像（1350 nm長通濾波器、808 nm激發，成像速率為每秒1幀）記錄信號波動，以研究無需開顱情況下腦部視野內的信號變化。在假手術NIR-IIa組中，NIR-II熒光強度隨注射后時間的延長而迅速增加。如預期所示，左側大腦中動脈（MCA）區域的NIR-IIa信號強度幾乎與相應的右側區域相等，表明雙側MCA區域的灌注率相同。在MCAO組中，4T-BSA納米探針的熒光信號（圖4b中綠色虛線圈標出）在注射后1秒內立即出現在右側MCA（對側）區域。值得注意的是，右側MCA的熒光信號迅速增加，并在注射后約40秒達到平穩，而左側MCA（同側）區域幾乎沒有NIR-IIa信號出現（圖4b中黃色虛線圈標出）。動態熒光信號波動分析表明，大腦左側MCA區域的血流灌注顯著減少。例如，右側MCA區域的腦血流灌注率比相應的左側缺血MCA區域高出約五倍。此外，在假手術組中，矢狀竇（SSS）的前后區域的NIR-IIa信號沒有明顯差異。令人印象深刻的是，在CVST組中，4T-BSA納米探針注射后，SSS前區域（圖4c中黃色虛線圈）的NIR-IIa熒光信號可以立即觀察到。同時，SSS后區域（圖4c中綠色虛線圈）的NIR-IIa信號幾乎可以忽略不計，這代表了血栓形成的部位。如圖4g總結所示，SSS前區域的腦血流灌注率比后區域高出約四倍，表明由于SSS后區域的竇血栓（阻塞）導致靜脈回流障礙。

圖5. 在體實時記錄腦內動脈或靜脈側支循環網絡的演變

研究人員探討了4T-BSA納米探針在大型顱內血管（大腦中動脈或矢狀竇）近端阻塞時，準確測量腦部微血管動靜脈側支循環的潛力。將整個小鼠頭部放置在激光下的成像平臺上，然后在通過尾靜脈向MCAO和CVST模型的C57BL/6小鼠體內注射35 nM的4T-BSA納米探針后，連續記錄90分鐘。

在MCAO組中，在低倍率（2.5×）下實時捕捉整個小鼠頭部的動態圖像，可用于觀察整個小鼠頭部（圖5a）。值得注意的是，NIR-IIa動態圖像（40分鐘）中的藍色箭頭代表一種血管畸形，這由4T-BSA納米探針在腦血管中的明亮發射強度證實。在放大左側大腦中動脈區域后，通過NIR-IIa動態成像的高倍率（10×）監測感興趣區域（圖5a中的藍色虛線矩形），以明確血流低灌注的細節。如圖所示，在注射4T-BSA納米探針后約15分鐘，明確觀察到單一毛細血管的血流灌注（圖5b中的白色箭頭）。圖5b中藍色虛線穿過血流灌注區域的橫截面強度輪廓證實了在注射4T-BSA納米探針后約15分鐘新生血管的出現（圖5d）。這些新生血管的特征是尖銳的峰值，半高全寬（FWHM）約為42微米。NIR-IIa血流灌注成像表明皮質動脈側支循環的開通，這可以支持大腦組織在阻塞的左側大腦中動脈區域的存活（圖5c）。同時，4T-BSA納米探針的流動可用于評估與動脈側支循環相關的血流灌注動態（圖5e）。基于MCAO模型大腦中動脈側支循環血流網絡演變的上述血流灌注研究發現，內在動脈側支循環的最大開通至少維持了65分鐘（圖5e），從而在急性缺血性疾病期間確保足夠的血流以支持大腦的存活。

在CVST模型中，可以輕松測量靜脈竇阻塞部位周圍的腦靜脈側支循環灌注（圖5f）。仔細觀察在注射4T-BSA納米探針后30分鐘內的連續放大NIR-IIa圖像，清楚地檢測到在阻塞的靜脈竇區域上方有許多復雜側支吻合發育（圖5g）。此外，發現多個側支連接從血栓周圍的腦血管（矢狀竇的中后區域）移動到矢狀竇的前區域（圖5g中的白色和藍色箭頭）。綜合來看，4T-BSA納米探針的NIR-IIa成像可以闡明側支血流灌注的高分辨率連續實時監測。對相同血管和吻合區域的橫截面強度輪廓進行定量分析，進一步證實了阻塞靜脈竇區域周圍的腦靜脈側支循環灌注（圖5h）。

本文建立了三種典型的神經病理生理學小鼠模型，即大腦中動脈閉塞（MCAO）、腦靜脈竇血栓形成（CVST）和癲癇，以準確模擬不同的BBB破壞行為（圖6a）。除了使用4T-BSA納米探針進行NIR-IIa成像外，還進行了詳細的近紅外一區（NIR-I）、磁共振成像（MRI）和Evans藍（EB）標記白蛋白腦成像，以表征BBB特性的相對變化。

在再灌注后2到72小時內，MCAO模型小鼠中發現了顯著的熒光信號（圖6b中的藍色箭頭），表明與對側相比，缺血半球中4T-BSA納米探針的外滲和積累更多。4T-BSA納米探針的泄漏信號強度和面積隨時間緩慢增加和擴展（圖6g）。值得注意的是，在再灌注后72小時從小鼠頭骨中取出整個大腦進行離體NIR-IIa成像，可以在缺血MCA區域保持強烈的熒光信號（圖6g中的灰色曲線），表明4T-BSA納米探針明顯外滲（圖6c，左）。同時，對約20微米厚的大腦冠狀切片進行NIR-IIa顯微成像證實了BBB破壞行為（圖6d），這由MCAO區域缺血半球中4T-BSA納米探針的明顯外滲證明。在離體EB組（圖6e）中，這是腦切片中BBB泄漏的標準離體標記，EB外滲顯示出與MCAO模型中缺血MCAO區域的4T-BSA納米探針相似的空間分布，但劑量約為后者的35.7倍（1.25微米）且切片厚度大50倍（1毫米）（4T-BSA納米探針為35納米，20微米）。在這方面，4T-BSA納米探針可能有助于有效闡明病理條件下BBB的演變。

為了評估腦實質中血漿白蛋白的外滲，通過時間序列分析沿圖6b中藍色虛線的橫截面強度輪廓，測量了缺血MCAO區域上積累的4T-BSA納米探針信號。NIR-IIa信號在注射后8小時擴散到整個MCAO區域，并在16小時后超過MCAO區域的核心部分（圖6g）。這一發現表明，水腫形成的區域似乎先于MCAO區域，并伴隨著血漿成分的外滲（圖6c，左）。

此外，對于CVST NIR-IIa組，在通過尾靜脈注射4T-BSA納米探針（35 nM）后，進行了額外的腦靜脈缺血實驗，并監測了從1到45分鐘的時間序列NIR-IIa圖像。如圖6h所示，更高倍率（5×）的動態體內NIR-IIa圖像顯示在注射后10分鐘4T-BSA納米探針的泄漏。值得注意的是，在注射4T-BSA納米探針后16小時對CVST小鼠大腦進行的體內成像顯示，NIR-IIa信號以及觀察到的BBB破壞保留在缺血SSS區域（圖6i，左）。此外，CVST小鼠大腦的離體成像確定了SSS周圍4T-BSA納米探針的外滲（圖6j），與CVST小鼠（再灌注后16小時）通過靜脈注射EB染料進行的大腦離體成像非常相似（圖6k）。

在注射4T-BSA納米探針后2小時，觀察到雙側頂顳葉皮層和海馬周圍區域的強烈泄漏（圖6m）。有趣的是，在注射4T-BSA納米探針后16小時，歸因于BBB泄漏的NIR-IIa強度幾乎可以忽略不計（圖6m,n），暗示單次癲癇發作的可逆BBB破壞行為。使用EB染料的離體實驗證實了海馬和中腦周圍的BBB泄漏，而在頂顳葉皮層上有淡淡的藍色染色（圖6o）。

盡管越來越多的證據表明血腦屏障（BBB）通透性變化在常見神經疾病發病機制中的作用，但目前缺乏在生理和病理條件下研究微小腦血管BBB特性的高保真方法。為此，本文建立了三種典型的神經病理生理學小鼠模型，即大腦中動脈閉塞（MCAO）、腦靜脈竇血栓形成（CVST）和癲癇，這些模型可以準確模擬不同的BBB破壞行為（圖6a）。除了使用4T-BSA納米探針進行NIR-IIa成像外，還仔細進行了其他典型的近紅外一區（NIR-I）、磁共振成像（MRI）和 Evans藍（EB）標記白蛋白腦成像，以表征BBB特性的相對變化。

為了在MCAO組中實現動態體內NIR-IIa腦成像，將整個小鼠頭部安裝在激光下的成像位移臺上。在4T-BSA納米探針注射后，立即在狹窄的1350–1650 nm成像區域內進行無創NIR-IIa成像。在再灌注后2到72小時內，MCAO模型小鼠中發現了顯著的熒光信號（圖6b中的藍色箭頭），表明與對側相比，缺血半球中4T-BSA納米探針的外滲和積累更多。此外，對缺血MCAO區域的信號進行時間序列分析顯示，4T-BSA納米探針的泄漏信號強度和面積隨時間緩慢增加和擴展（圖6g；圖S10，支持信息）。值得注意的是，在再灌注后72小時從小鼠頭骨中取出整個大腦進行離體NIR-IIa成像，可以在缺血MCA區域保持強烈的熒光信號（圖6g中的灰色曲線），表明4T-BSA納米探針明顯外滲（圖6c，左）。同時，對約20微米厚的大腦冠狀切片進行NIR-IIa顯微成像證實了BBB破壞行為（圖6d），這由MCAO區域缺血半球中4T-BSA納米探針的明顯外滲證明。在離體EB組（圖6e）中，這是腦切片中BBB泄漏的標準離體標記，EB外滲顯示出與MCAO模型中缺血MCAO區域的4T-BSA納米探針相似的空間分布，但劑量約為后者的35.7倍（1.25微米）且切片厚度大50倍（1毫米）（4T-BSA納米探針為35納米，20微米）。在這方面，4T-BSA納米探針可能有助于有效闡明病理條件下BBB的演變。

為了評估腦實質中血漿白蛋白的外滲，通過時間序列分析沿圖6b中藍色虛線的橫截面強度輪廓，測量了缺血MCAO區域上積累的4T-BSA納米探針信號。被困的NIR-IIa信號將在注射后8小時擴散到整個MCAO區域，并在16小時后超過MCAO區域的核心部分（圖6g）。這一發現表明，水腫形成的區域似乎先于MCAO區域，并伴隨著血漿成分的外滲（圖6c，左）。

此外，對于CVST NIR-IIa組，在通過尾靜脈注射4T-BSA納米探針（35 nM）后，進行了額外的腦靜脈缺血實驗，并監測了從1到45分鐘的時間序列NIR-IIa圖像。如圖6h所示，更高倍率（5×）的動態體內NIR-IIa圖像顯示在注射后10分鐘4T-BSA納米探針的泄漏。在45分鐘的測量時間窗口內，每5分鐘成功追蹤一次靠近上矢狀竇的腦實質中4T-BSA納米探針的積累。值得注意的是，在注射4T-BSA納米探針后16小時對CVST小鼠大腦進行的體內成像顯示，NIR-IIa信號以及觀察到的BBB破壞保留在缺血SSS區域（圖6i，左）。此外，CVST小鼠大腦的離體成像確定了SSS周圍4T-BSA納米探針的外滲（圖6j），與CVST小鼠（再灌注后16小時）通過靜脈注射EB染料進行的大腦離體成像非常相似（圖6k）。

為了進一步研究4T-BSA納米探針檢測BBB通透性的靈敏度和穿透深度，通過記錄單次腹腔注射戊四氮后的潛伏期和強度1小時，建立了戊四氮誘發的癲癇小鼠模型，然后通過尾靜脈注射4T-BSA納米探針（35納米）以觀察BBB的完整性。在NIR-IIa成像窗口下，可以在戊四氮誘發的癲癇發作的大腦中發現典型的BBB破壞模式，這由多個區域的4T-BSA納米探針外滲證明。例如，在注射4T-BSA納米探針后2小時，觀察到雙側頂顳葉皮層和海馬周圍區域的強烈泄漏（圖6m）。有趣的是，在注射4T-BSA納米探針后16小時，歸因于BBB泄漏的NIR-IIa強度幾乎可以忽略不計（圖6m,n），暗示單次癲癇發作的可逆BBB破壞行為。使用EB染料的離體實驗證實了海馬和中腦周圍的BBB泄漏，而在頂顳葉皮層上有淡淡的藍色染色（圖6o）。上述成像數據表明，4T-BSA納米探針允許對完整小鼠大腦中的細微BBB通透性進行無創體內監測，具有高清晰度和深穿透性。

作為比較，在NIR-I組中，分別將ICG-BSA納米探針（35 nM）通過尾靜脈注射到三種典型的神經病理生理學模型中。在MCAO、CVST和癲癇小鼠模型的缺血區域周圍未監測到體內顯著變化（圖6c,i的右側面板；圖S11，支持信息）。例如，在MCAO小鼠模型中，ICG-BSA納米探針的發射波長較短，無法在再灌注后72小時從頭骨中取出的大腦進行高質量的離體NIR-I成像（圖6c，右側面板）。對于MRI對照組，在靜脈注射Gd-DTPA放射性示蹤劑后立即進行對比后T1加權成像，這歸因于其非常短的血漿半衰期。值得注意的是，無論是在MCAO、CVST還是癲癇神經小鼠模型中，對比增強成像只能在缺血區域的邊緣檢測到（圖6f,l,p）。上述成像方式的聯合支持了一個令人信服的結果，即4T-BSA納米探針在NIR-IIa成像窗口中顯示出高保真和持續記錄BBB通透性的巨大潛力。

4T-BSA納米探針解析了通過完整頭皮和頭骨對整個小鼠大腦進行大視場成像的血流動力學。使用4T-BSA納米探針的NIR-IIa成像清晰地證明了不同神經病理生理學模型的成功建立。MCAO模型可以評估4T-BSA納米探針動態穿透受損血腦屏障（BBB）并靶向缺血驅動生物標志物的能力。CVST模型用于強調4T-BSA納米探針在低流量靜脈系統中血栓成像的特異性，突出其區分動脈與靜脈血栓的潛力。癲癇模型旨在驗證4T-BSA納米探針對早期微血管異常檢測的敏感性。4T-BSA納米探針可以通過分析動態熒光信號波動定量研究血流動力學腦灌注率。

參考文獻

Chen S, Chen H, Li X, et al. Dynamic Pathophysiological Insight into the Brain by NIR‐II Imaging[J]. Advanced Science, 2025: 2416390.

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