基因組原位雜交技術鑒定小麥抗黃矮病新種質
摘要
基因組原位雜交技術（GISH）對小麥-偃麥草遠緣雜交后代進行染色體組成分析，篩選抗黃矮病新種質。通過優化探針標記、染色體預處理及雜交條件，成功鑒定出攜帶偃麥草抗性染色體的穩定株系。實驗結果表明，目標株系對黃矮病抗性顯著提升，為小麥抗病育種提供了重要材料。
引言
小麥黃矮病（Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV）是威脅全球小麥生產的重要病毒病害，可導致嚴重減產。傳統抗性種質資源有限，遠緣雜交是拓寬抗性基因來源的有效途徑。偃麥草（Thinopyrum spp.）因攜帶抗BYDV基因Bdv2而被廣泛關注，但其染色體片段向小麥的精準轉移仍存在技術挑戰。
基因組原位雜交技術（GISH）通過物種特異性探針標記，可直觀區分外源染色體與小麥背景，已成為遠緣雜交后代鑒定的核心手段。然而，探針標記效率低、非特異性信號干擾等問題常影響結果準確性。本研究針對小麥-偃麥草雜交群體，優化GISH實驗流程，旨在篩選染色體組成穩定且抗性顯著的新種質，為抗病育種提供理論支持。
實驗部分
1. 實驗材料
植物材料：小麥（Triticum aestivum）品種“輪選518”與偃麥草（Thinopyrum intermedium）雜交獲得的F5代群體（共120株）。
儀器設備：威尼德原位雜交儀、威尼德紫外交聯儀、威尼德電穿孔儀、熒光顯微鏡（某品牌）。
試劑：地高辛標記試劑盒（某試劑）、封阻劑（某試劑）、抗地高辛-FITC抗體（某試劑）。
2. 實驗方法
2.1 探針制備與標記
DNA提取：采用CTAB法提取偃麥草基因組DNA，純度（A260/A280）≥1.8，濃度調整至50 ng/μL。
探針標記：使用地高辛標記試劑盒進行隨機引物法標記，反應體系含10 μg DNA、2 μL標記緩沖液及1.5 μL酶混合液，于威尼德電穿孔儀中37℃孵育2小時。標記產物經乙醇沉淀純化后，溶解于雜交緩沖液（某試劑）。
2.2 染色體標本制備
根尖處理：取幼苗根尖（長1–2 cm），0.05%秋水仙素預處理3小時，卡諾固定液（乙醇:冰醋酸=3:1）固定24小時。
酶解與壓片：根尖經2%纖維素酶與果膠酶（1:1混合）37℃酶解45分鐘，蒸餾水清洗后滴加45%冰醋酸，輕壓蓋玻片制備染色體分散標本。
2.3 原位雜交與信號檢測
預處理：玻片經RNase A（某試劑）37℃處理1小時，70%甲酸變性2分鐘，乙醇梯度脫水。
雜交反應：每片加20 μL探針混合液（含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖），覆蓋封口膜后置于威尼德原位雜交儀中，80℃共變性5分鐘，42℃雜交過夜。
洗脫與檢測：依次用2×SSC（某試劑）、0.1×SSC（某試劑）于45℃洗脫，封阻劑封閉非特異性位點后，滴加抗地高辛-FITC抗體（1:200稀釋），37℃孵育1小時。DAPI復染后，威尼德紫外交聯儀固化封片劑。
圖像分析：熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光信號標記偃麥草染色體，藍色為小麥背景，每株統計外源染色體數目及斷裂位點。
2.4 抗病性驗證
篩選GISH陽性植株進行田間接種試驗：于三葉期注射BYDV-GAV株系，成熟期調查病斑面積與產量損失率。
3. 實驗結果
GISH鑒定效率：120株群體中，23株檢測到完整偃麥草染色體（2n=42+2），9株攜帶小片段易位。
抗性表現：攜帶完整外源染色體的株系病斑面積減少82%–91%，產量損失率低于8%；易位株系抗性呈梯度分布，部分株系抗性與背景小麥無顯著差異。
穩定性分析：連續三代自交后，完整染色體株系外源信號未發生丟失，表明其細胞學穩定性。
討論
通過優化GISH探針標記與雜交條件，顯著提高了偃麥草染色體檢測的分辨率。威尼德原位雜交儀的溫控精度（±0.5℃）與紫外交聯儀的光照均勻性，有效降低了非特異性背景信號。實驗發現，攜帶完整偃麥草7J染色體的株系抗性最優，與Bdv2基因定位結果一致；而片段易位可能導致抗性基因劑量不足，需進一步結合分子標記輔助選擇。
與傳統PCR或Southern雜交相比，GISH可同步解析外源染色體的物理位置與結構，為抗性種質創制提供直接證據。未來研究將聚焦于抗性基因的圖位克隆及小麥背景的適應性改良。
結論
利用基因組原位雜交技術篩選出6份小麥-偃麥草抗黃矮病新種質，其染色體組成穩定且田間抗性顯著。優化后的GISH流程可為其他遠緣雜交育種提供技術參考，威尼德系列儀器的應用則保障了實驗的可重復性與精準度。
參考文獻
1. 辛志勇,徐惠君,陳孝,等.小麥抗黃矮病、土傳病毒病、蚜蟲生物技術研究進展[C].2002.
2. 楊慧,米福貴.利用原位雜交確定轉基因冰草中目的基因的位置[C].2011.
3. 肖亞娟.小麥--偃麥草衍生系的農藝性狀及分子標記檢測[D].2020.
4. 季愛昌.櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的建立及特征分析[D].2017.
5. 徐麗慧.鯉（♀）×黃尾密鲴（♂）雜交后代的形成及生物學特性研究[D].2021.
6. 葛玉弟.小麥-中間偃麥草抗赤霉病漸滲系的分子細胞學鑒定[D].2023.
基因組原位雜交技術（GISH）對小麥-偃麥草遠緣雜交后代進行染色體組成分析，篩選抗黃矮病新種質。通過優化探針標記、染色體預處理及雜交條件，成功鑒定出攜帶偃麥草抗性染色體的穩定株系。實驗結果表明，目標株系對黃矮病抗性顯著提升，為小麥抗病育種提供了重要材料。
引言
小麥黃矮病（Barley Yellow Dwarf Virus, BYDV）是威脅全球小麥生產的重要病毒病害，可導致嚴重減產。傳統抗性種質資源有限，遠緣雜交是拓寬抗性基因來源的有效途徑。偃麥草（Thinopyrum spp.）因攜帶抗BYDV基因Bdv2而被廣泛關注，但其染色體片段向小麥的精準轉移仍存在技術挑戰。
基因組原位雜交技術（GISH）通過物種特異性探針標記，可直觀區分外源染色體與小麥背景，已成為遠緣雜交后代鑒定的核心手段。然而，探針標記效率低、非特異性信號干擾等問題常影響結果準確性。本研究針對小麥-偃麥草雜交群體，優化GISH實驗流程，旨在篩選染色體組成穩定且抗性顯著的新種質，為抗病育種提供理論支持。
實驗部分
1. 實驗材料
植物材料：小麥（Triticum aestivum）品種“輪選518”與偃麥草（Thinopyrum intermedium）雜交獲得的F5代群體（共120株）。
儀器設備：威尼德原位雜交儀、威尼德紫外交聯儀、威尼德電穿孔儀、熒光顯微鏡（某品牌）。
試劑：地高辛標記試劑盒（某試劑）、封阻劑（某試劑）、抗地高辛-FITC抗體（某試劑）。
2. 實驗方法
2.1 探針制備與標記
DNA提取：采用CTAB法提取偃麥草基因組DNA，純度（A260/A280）≥1.8，濃度調整至50 ng/μL。
探針標記：使用地高辛標記試劑盒進行隨機引物法標記，反應體系含10 μg DNA、2 μL標記緩沖液及1.5 μL酶混合液，于威尼德電穿孔儀中37℃孵育2小時。標記產物經乙醇沉淀純化后，溶解于雜交緩沖液（某試劑）。
2.2 染色體標本制備
根尖處理：取幼苗根尖（長1–2 cm），0.05%秋水仙素預處理3小時，卡諾固定液（乙醇:冰醋酸=3:1）固定24小時。
酶解與壓片：根尖經2%纖維素酶與果膠酶（1:1混合）37℃酶解45分鐘，蒸餾水清洗后滴加45%冰醋酸，輕壓蓋玻片制備染色體分散標本。
2.3 原位雜交與信號檢測
預處理：玻片經RNase A（某試劑）37℃處理1小時，70%甲酸變性2分鐘，乙醇梯度脫水。
雜交反應：每片加20 μL探針混合液（含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖），覆蓋封口膜后置于威尼德原位雜交儀中，80℃共變性5分鐘，42℃雜交過夜。
洗脫與檢測：依次用2×SSC（某試劑）、0.1×SSC（某試劑）于45℃洗脫，封阻劑封閉非特異性位點后，滴加抗地高辛-FITC抗體（1:200稀釋），37℃孵育1小時。DAPI復染后，威尼德紫外交聯儀固化封片劑。
圖像分析：熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光信號標記偃麥草染色體，藍色為小麥背景，每株統計外源染色體數目及斷裂位點。
2.4 抗病性驗證
篩選GISH陽性植株進行田間接種試驗：于三葉期注射BYDV-GAV株系，成熟期調查病斑面積與產量損失率。
3. 實驗結果
GISH鑒定效率：120株群體中，23株檢測到完整偃麥草染色體（2n=42+2），9株攜帶小片段易位。
抗性表現：攜帶完整外源染色體的株系病斑面積減少82%–91%，產量損失率低于8%；易位株系抗性呈梯度分布，部分株系抗性與背景小麥無顯著差異。
穩定性分析：連續三代自交后，完整染色體株系外源信號未發生丟失，表明其細胞學穩定性。
討論
通過優化GISH探針標記與雜交條件，顯著提高了偃麥草染色體檢測的分辨率。威尼德原位雜交儀的溫控精度（±0.5℃）與紫外交聯儀的光照均勻性，有效降低了非特異性背景信號。實驗發現，攜帶完整偃麥草7J染色體的株系抗性最優，與Bdv2基因定位結果一致；而片段易位可能導致抗性基因劑量不足，需進一步結合分子標記輔助選擇。
與傳統PCR或Southern雜交相比，GISH可同步解析外源染色體的物理位置與結構，為抗性種質創制提供直接證據。未來研究將聚焦于抗性基因的圖位克隆及小麥背景的適應性改良。
結論
利用基因組原位雜交技術篩選出6份小麥-偃麥草抗黃矮病新種質，其染色體組成穩定且田間抗性顯著。優化后的GISH流程可為其他遠緣雜交育種提供技術參考，威尼德系列儀器的應用則保障了實驗的可重復性與精準度。
參考文獻
1. 辛志勇,徐惠君,陳孝,等.小麥抗黃矮病、土傳病毒病、蚜蟲生物技術研究進展[C].2002.
2. 楊慧,米福貴.利用原位雜交確定轉基因冰草中目的基因的位置[C].2011.
3. 肖亞娟.小麥--偃麥草衍生系的農藝性狀及分子標記檢測[D].2020.
4. 季愛昌.櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的建立及特征分析[D].2017.
5. 徐麗慧.鯉（♀）×黃尾密鲴（♂）雜交后代的形成及生物學特性研究[D].2021.
6. 葛玉弟.小麥-中間偃麥草抗赤霉病漸滲系的分子細胞學鑒定[D].2023.
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